ddRFC:一種可擴展的多重液滴數(shù)字化核酸擴增檢測平臺
發(fā)布時間：2024-07-31 瀏覽次數(shù)：251
數(shù)字化核酸擴增檢測（Digital nucleic acid amplification tests，dNAATs）因其高靈敏度和高特異性，已成為一種流行的核酸檢測工具。然而，現(xiàn)有的大多數(shù)dNAATs平臺都依托于“單色單靶標(biāo)”的檢測策略，這樣的方法面臨著光譜重疊的問題，且靶標(biāo)檢測重數(shù)受限于觀測設(shè)備的熒光通道數(shù)目。為擴展dNNATs的多重檢測能力，約翰霍普金斯大學(xué)的Tza-Huei Wang團隊開發(fā)了一個多重液滴數(shù)字化核酸擴增檢測平臺，名為ddRFC（Droplet Digital Ratiometric Fluorescence Coding），該研究成果于2020年發(fā)表在《Biosensors and Bioelectronics》上。
dNAATs是一種在大量體積為fL到μL的反應(yīng)單元中定量目標(biāo)核酸分子的絕對定量方法。基于微流控發(fā)展的dNAATs具有下列優(yōu)勢：1）試樣量消耗少；2）靈敏度高。相較于基于毫升體積的NAATs，微小的反應(yīng)單元大大增加了目標(biāo)分子的局部濃度，降低了體系中存在的反應(yīng)抑制劑和多重反應(yīng)體系中存在的競爭底物的干擾效應(yīng)，由此提高了整體的檢測靈敏度和特異性。也正因為此，dNAATs越來越多地應(yīng)用于病原鑒定，遺傳疾病篩查和癌癥診斷等領(lǐng)域。然而，目前大多數(shù)dNAATs平臺都存在多重檢測能力不足以滿足感染性疾病“多靶標(biāo)齊篩選”的問題。這些平臺大多基于“單色單靶標(biāo)”的檢測策略，這使得方法的多路復(fù)用能力受限于檢測設(shè)備可用的熒光通道的數(shù)量（≤6）。然而，為了避免光譜重疊問題，并考慮到成本造價，大多數(shù)商用的dNAATs設(shè)備，例如BioRad ddPCR?和QuantStudio? (Thermo Fisher)僅有2個熒光通道。為擴展dNAATs的多重檢測能力，已有科研人員提出用熒光強度編碼目標(biāo)核酸來避免“單色單靶標(biāo)”面臨的挑戰(zhàn)，盡管此方案可以在現(xiàn)有的2色檢測器的范圍內(nèi)工作，但這種策略需要大量實驗來優(yōu)化引物/探針集的濃度，以平衡擴增效率、特異性以及競爭動力學(xué)?；诖搜芯勘尘?，Tza-Huei Wang課題組提出了一個液滴數(shù)字化熒光比率編碼（ddRFC）的多重dNAATs策略，反應(yīng)原理可以概括為：通過在靶標(biāo)特異性鎖式探針上結(jié)合不同比率的兩種顏色的分子信標(biāo)，將其作為待檢靶標(biāo)的編碼，形成液滴后進行HRCA反應(yīng)，觀測每個液滴的雙色熒光信號強度，實現(xiàn)相應(yīng)目標(biāo)分子的多重定量。
研究所用的鎖式探針包括3個部分：與靶標(biāo)序列互補的2個末端；熒光編碼區(qū)域（分子信標(biāo)結(jié)合位點）以及HRCA通用引物結(jié)合位點。作者設(shè)計了6種靶標(biāo)特異性鎖式探針（僅使用2個不同熒光基團的分子信標(biāo)），分別用于6種性傳播病毒的檢測：MG，HSV，NG，HIV，TP，CT，其對應(yīng)的R/G編碼分別為：0:1；1:4；1:1；2:1；4:1；1:0。其實驗流程可以概述為：①將6種線型鎖式探針和待檢DNA混合樣本于55℃下孵育1h；②探針與對應(yīng)靶標(biāo)結(jié)合后，線型則會轉(zhuǎn)變成環(huán)狀。向反應(yīng)體系中加入HRCA通用引物和分子信標(biāo)混合后形成3 pL液滴，收集于離心管中并于60℃孵育2 h，進行HRCA反應(yīng)。隨后95℃，5 min使酶失活，37℃ 20min使得分子信標(biāo)結(jié)合到鎖式探針結(jié)合位點上。③液滴注入檢測通道，通過設(shè)計的系統(tǒng)測定熒光強度，MATLAB處理數(shù)據(jù)（圖1）。
圖1 ddRFC檢測6種性傳播病毒的設(shè)計原理（A-B）和實驗流程（C）
作者首先利用合成的6種病毒的寡核苷酸進行了單重能力驗證，結(jié)果顯示液滴的相對熒光強度與設(shè)定的R/G值具有很好的相關(guān)性（圖2A）。作者也繪制了每種設(shè)定R/G值下的陽性液滴的紅色和綠色熒光強度的二維散點圖，如圖2B，可以觀察到6個分離良好的種群，且測得的R/G值與設(shè)定值存在良好的線性關(guān)系（圖2C），由此證明了方法的可行性。隨后，作者展開了二重、四重乃至六重實驗，根據(jù)所得的散點圖，證明了方法的多重檢測能力（圖3）。
圖2 （A）LIF系統(tǒng)記錄的每個液滴的紅色和綠色熒光時間軌跡；（B）6個樣本的紅色和綠色熒光強度二維散點圖；（C）測量的R/G平均值與設(shè)計的R/G值的線性相關(guān)性，每個樣本至少統(tǒng)計1000個陽性液滴。
圖3 ddRFC的多重檢測能力驗證，所用的模板全是合成的寡核苷酸。（A）NG和HIV混合樣本檢測結(jié)果中各至少1000個陽性液滴的紅色和綠色熒光強度的二維散點圖；（B）HIV與NG比值的測量值與理論值之間的線性關(guān)系（R2=0.9995，n=3）；（C）NG、HIV、CT和MG混合樣本檢測結(jié)果中各至少1000個陽性液滴的紅色和綠色熒光強度的二維散點圖；（D）NG、HIV、CT、MG、CT和HSV混合樣本檢測結(jié)果中各至少1000個陽性液滴的紅色和綠色熒光強度的二維散點圖。
總的來說，該團隊發(fā)展的ddRFC具有以下創(chuàng)新性優(yōu)勢：1）利用成環(huán)鎖式探針為每個目標(biāo)基因分配了預(yù)先設(shè)計的熒光強度比值，消除了“單色單靶標(biāo)”存在的光譜重疊的影響問題；2）僅用2個標(biāo)準(zhǔn)熒光基團即可實現(xiàn)6種性傳播病毒的檢測，具有較強的多重可擴展能力；3）只需改變分子信標(biāo)結(jié)合位點的數(shù)量，無需改變HRCA的引物和更換分子信標(biāo)，經(jīng)濟高效。不過，本文中該方法在定量能力和實際臨床樣本上確無過多體現(xiàn)。但是，隨著進一步的改進和發(fā)展，ddRFC仍有很大潛力成為大規(guī)模多重核酸檢測的強大的dNAATs平臺，作為未來更多疾病的診斷工具。
原文鏈接：https://doi.org/10.1016/j.bios.2020.112499
來源：微生物安全與健康網(wǎng)
鏈接：https://www.mbiosh.com/column/testing-technology/testing-technology-method/28023
