ddRFC:一種可擴展的多重液滴數(shù)字化核酸擴增檢測平臺
發(fā)布時間：2024-07-31 瀏覽次數(shù)：203
數(shù)字化核酸擴增檢測（Digital nucleic acid amplification tests，dNAATs）因其高靈敏度和高特異性，已成為一種流行的核酸檢測工具。然而，現(xiàn)有的大多數(shù)dNAATs平臺都依托于“單色單靶標”的檢測策略，這樣的方法面臨著光譜重疊的問題，且靶標檢測重數(shù)受限于觀測設備的熒光通道數(shù)目。為擴展dNNATs的多重檢測能力，約翰霍普金斯大學的Tza-Huei Wang團隊開發(fā)了一個多重液滴數(shù)字化核酸擴增檢測平臺，名為ddRFC（Droplet Digital Ratiometric Fluorescence Coding），該研究成果于2020年發(fā)表在《Biosensors and Bioelectronics》上。
dNAATs是一種在大量體積為fL到μL的反應單元中定量目標核酸分子的絕對定量方法?；谖⒘骺匕l(fā)展的dNAATs具有下列優(yōu)勢：1）試樣量消耗少；2）靈敏度高。相較于基于毫升體積的NAATs，微小的反應單元大大增加了目標分子的局部濃度，降低了體系中存在的反應抑制劑和多重反應體系中存在的競爭底物的干擾效應，由此提高了整體的檢測靈敏度和特異性。也正因為此，dNAATs越來越多地應用于病原鑒定，遺傳疾病篩查和癌癥診斷等領域。然而，目前大多數(shù)dNAATs平臺都存在多重檢測能力不足以滿足感染性疾病“多靶標齊篩選”的問題。這些平臺大多基于“單色單靶標”的檢測策略，這使得方法的多路復用能力受限于檢測設備可用的熒光通道的數(shù)量（≤6）。然而，為了避免光譜重疊問題，并考慮到成本造價，大多數(shù)商用的dNAATs設備，例如BioRad ddPCR?和QuantStudio? (Thermo Fisher)僅有2個熒光通道。為擴展dNAATs的多重檢測能力，已有科研人員提出用熒光強度編碼目標核酸來避免“單色單靶標”面臨的挑戰(zhàn)，盡管此方案可以在現(xiàn)有的2色檢測器的范圍內(nèi)工作，但這種策略需要大量實驗來優(yōu)化引物/探針集的濃度，以平衡擴增效率、特異性以及競爭動力學。基于此研究背景，Tza-Huei Wang課題組提出了一個液滴數(shù)字化熒光比率編碼（ddRFC）的多重dNAATs策略，反應原理可以概括為：通過在靶標特異性鎖式探針上結合不同比率的兩種顏色的分子信標，將其作為待檢靶標的編碼，形成液滴后進行HRCA反應，觀測每個液滴的雙色熒光信號強度，實現(xiàn)相應目標分子的多重定量。
研究所用的鎖式探針包括3個部分：與靶標序列互補的2個末端；熒光編碼區(qū)域（分子信標結合位點）以及HRCA通用引物結合位點。作者設計了6種靶標特異性鎖式探針（僅使用2個不同熒光基團的分子信標），分別用于6種性傳播病毒的檢測：MG，HSV，NG，HIV，TP，CT，其對應的R/G編碼分別為：0:1；1:4；1:1；2:1；4:1；1:0。其實驗流程可以概述為：①將6種線型鎖式探針和待檢DNA混合樣本于55℃下孵育1h；②探針與對應靶標結合后，線型則會轉變成環(huán)狀。向反應體系中加入HRCA通用引物和分子信標混合后形成3 pL液滴，收集于離心管中并于60℃孵育2 h，進行HRCA反應。隨后95℃，5 min使酶失活，37℃ 20min使得分子信標結合到鎖式探針結合位點上。③液滴注入檢測通道，通過設計的系統(tǒng)測定熒光強度，MATLAB處理數(shù)據(jù)（圖1）。
圖1 ddRFC檢測6種性傳播病毒的設計原理（A-B）和實驗流程（C）
作者首先利用合成的6種病毒的寡核苷酸進行了單重能力驗證，結果顯示液滴的相對熒光強度與設定的R/G值具有很好的相關性（圖2A）。作者也繪制了每種設定R/G值下的陽性液滴的紅色和綠色熒光強度的二維散點圖，如圖2B，可以觀察到6個分離良好的種群，且測得的R/G值與設定值存在良好的線性關系（圖2C），由此證明了方法的可行性。隨后，作者展開了二重、四重乃至六重實驗，根據(jù)所得的散點圖，證明了方法的多重檢測能力（圖3）。
圖2 （A）LIF系統(tǒng)記錄的每個液滴的紅色和綠色熒光時間軌跡；（B）6個樣本的紅色和綠色熒光強度二維散點圖；（C）測量的R/G平均值與設計的R/G值的線性相關性，每個樣本至少統(tǒng)計1000個陽性液滴。
圖3 ddRFC的多重檢測能力驗證，所用的模板全是合成的寡核苷酸。（A）NG和HIV混合樣本檢測結果中各至少1000個陽性液滴的紅色和綠色熒光強度的二維散點圖；（B）HIV與NG比值的測量值與理論值之間的線性關系（R2=0.9995，n=3）；（C）NG、HIV、CT和MG混合樣本檢測結果中各至少1000個陽性液滴的紅色和綠色熒光強度的二維散點圖；（D）NG、HIV、CT、MG、CT和HSV混合樣本檢測結果中各至少1000個陽性液滴的紅色和綠色熒光強度的二維散點圖。
總的來說，該團隊發(fā)展的ddRFC具有以下創(chuàng)新性優(yōu)勢：1）利用成環(huán)鎖式探針為每個目標基因分配了預先設計的熒光強度比值，消除了“單色單靶標”存在的光譜重疊的影響問題；2）僅用2個標準熒光基團即可實現(xiàn)6種性傳播病毒的檢測，具有較強的多重可擴展能力；3）只需改變分子信標結合位點的數(shù)量，無需改變HRCA的引物和更換分子信標，經(jīng)濟高效。不過，本文中該方法在定量能力和實際臨床樣本上確無過多體現(xiàn)。但是，隨著進一步的改進和發(fā)展，ddRFC仍有很大潛力成為大規(guī)模多重核酸檢測的強大的dNAATs平臺，作為未來更多疾病的診斷工具。
原文鏈接：https://doi.org/10.1016/j.bios.2020.112499
來源：微生物安全與健康網(wǎng)
鏈接：https://www.mbiosh.com/column/testing-technology/testing-technology-method/28023
