稀釋涂布平板法計(jì)數(shù)菌落數(shù)的操作及注意事項(xiàng)
發(fā)布時(shí)間：2024-07-24 瀏覽次數(shù)：5023
01、稀涂布平板法操作步驟
稀釋涂布平板法是一種常用的微生物數(shù)量測(cè)定方法，它通過(guò)將樣品進(jìn)行一系列稀釋，然后將不同稀釋度的菌液涂布到固體培養(yǎng)基表面，經(jīng)過(guò)培養(yǎng)后，由每個(gè)單細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖而形成肉眼可見(jiàn)的菌落，從而估算原始樣品中的活菌數(shù)量。具體步驟如下：
1）實(shí)驗(yàn)室準(zhǔn)備：確保實(shí)驗(yàn)室環(huán)境清潔、干燥、無(wú)塵、無(wú)霉菌，操作臺(tái)、器皿、試劑應(yīng)清洗干凈并消毒處理。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)備有必要的設(shè)備和器具，如移液器、量筒、加熱器、平板計(jì)數(shù)器等。實(shí)驗(yàn)人員應(yīng)穿戴干凈、無(wú)菌的實(shí)驗(yàn)服裝和手套。
2）樣品處理：選擇代表性、均勻的樣品，并按照要求采集。樣品應(yīng)在規(guī)定時(shí)間內(nèi)送達(dá)實(shí)驗(yàn)室，盡快進(jìn)行處理。樣品應(yīng)在處理前進(jìn)行預(yù)處理，如過(guò)濾、破碎、稀釋等。
3）平板制備：準(zhǔn)備平板和培養(yǎng)基，根據(jù)需要配置適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基（不同微生物需要選擇不同營(yíng)養(yǎng)成分的培養(yǎng)基）。將平板培養(yǎng)基加熱至沸騰，然后冷卻至適宜的溫度（通常為45-50℃）。將冷卻好的培養(yǎng)基均勻地倒入空平板中，使其均勻分布在整個(gè)平板上，根據(jù)平板的大小，傾倒至培養(yǎng)基厚度約為0.5cm左右即可。除了自己倒平板外也可以使用商品化成品固體培養(yǎng)基。
4）稀釋涂布：先稀釋后涂布。將待測(cè)樣品進(jìn)行一系列梯度稀釋，一般情況下10倍、100倍、1000倍等稀釋。將不同稀釋程度的菌液分別涂布到固體培養(yǎng)基的表面，隨后將平板平放于實(shí)驗(yàn)臺(tái)上15-20min,使菌液滲透并固化，將平板倒置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（通常培養(yǎng)24-48h）。
5）菌落計(jì)數(shù)：培養(yǎng)后，統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目，計(jì)算出樣品中的含菌數(shù)。計(jì)數(shù)原則：平板上菌落數(shù)30-300之間為合格。如果只有一個(gè)稀釋度的平均菌落數(shù)符合要求，則以該稀釋度平均菌落數(shù)除以涂布平板所用稀釋液體積（0.1mL），乘以稀釋倍數(shù)作為該樣品的細(xì)菌總數(shù)。如果有兩個(gè)稀釋度的平均菌落數(shù)符合要求，則按照兩者菌落總數(shù)之比來(lái)決定，如果小于2，取兩者的平均值；如果大于2，取較小的菌落總數(shù)。
02、稀涂布平板法注意事項(xiàng)
① 整個(gè)過(guò)程需要保證在無(wú)菌條件下進(jìn)行，以防止雜菌污染。
② 注意稀釋液的準(zhǔn)確性，避免誤差。稀釋比例應(yīng)該根據(jù)菌液的濃度進(jìn)行調(diào)整，通常使用10倍系列稀釋法進(jìn)行稀釋。如果菌液濃度較高，可以采用更大稀釋比例，以避免平板上出現(xiàn)過(guò)多的菌落。
③ 涂布平板時(shí)要均勻一致，以保證菌落計(jì)數(shù)的準(zhǔn)確性。涂布時(shí)可以采用涂抹、劃線或點(diǎn)植等方法，具體方法應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求和培養(yǎng)基性質(zhì)選擇。
④ 在計(jì)數(shù)時(shí)要選擇菌落數(shù)穩(wěn)定且分布均勻的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)，避免誤差。
⑤ 在進(jìn)行稀釋涂布平板法時(shí)，需要保證實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性。每個(gè)實(shí)驗(yàn)應(yīng)該設(shè)置多個(gè)重復(fù)組（通常一個(gè)稀釋度進(jìn)行3-5次重復(fù)），以避免實(shí)驗(yàn)結(jié)果的偶然性和誤差。
⑥ 在稀釋過(guò)程中，要注意取液量要準(zhǔn)確，并且每次稀釋后，要將稀釋液混合均勻，再進(jìn)行下一步稀釋。
⑦ 無(wú)論是涂布還是傾注接種，都要讓微生物分布均勻，且盡量靠近中間，遠(yuǎn)離邊緣，因?yàn)榫渖L(zhǎng)在邊緣時(shí)，不容易讀取，且易連成片。
⑧ 設(shè)置對(duì)照，以排除操作過(guò)程中可能的污染。
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