產(chǎn)品名稱：產(chǎn)腸毒素大腸埃希氏菌 ETEC核酸檢測(cè)試劑盒(PCR-熒光探針法)
英文名稱：Multiplex PCR Detection Kit for Enterotoxigenic E.coli (Fluorescent Probe Assays)
產(chǎn)品編號(hào)與包裝規(guī)格：
| 編號(hào) | 規(guī)格 |
| FZ019BF2 | 48 測(cè)試/盒 |
產(chǎn)品簡(jiǎn)介：本試劑盒僅適用于食品樣本中產(chǎn)腸毒素大腸埃希氏菌 ETEC 的定性檢測(cè)。
檢測(cè)原理：基于 Real Time PCR 技術(shù)，利用針對(duì)腸桿菌科的16S rRNA 基因和ETEC的毒力基因 stp、sth、lt 設(shè)計(jì)的引物、熒光探針以及其他反應(yīng)優(yōu)化配置所需試劑，加入待檢樣品即可進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。在發(fā)生擴(kuò)增過程中，熒光探針與目的基因片段結(jié)合，可被 Taq 酶分解并產(chǎn)生熒光信號(hào)，此時(shí)熒光定量 PCR 儀可識(shí)別該熒光信號(hào)，同時(shí)根據(jù)其強(qiáng)弱變化繪制出相應(yīng)的實(shí)時(shí)擴(kuò)增曲線，進(jìn)而判定產(chǎn)腸毒素大腸埃希氏菌 ETEC 的類型。
stp、sth、lt、16S rRNA 基因分別對(duì)應(yīng)熒光報(bào)告基團(tuán) FAM、VIC、ROX、Cy5。
產(chǎn)腸毒素大腸埃希氏菌 ETEC核酸檢測(cè)試劑盒(PCR-熒光探針法)產(chǎn)品組分：
儲(chǔ)存條件與保質(zhì)期：-20℃避光儲(chǔ)存，有效期為 12 個(gè)月，避免反復(fù)凍融。
靈敏度：單通道最低檢驗(yàn)限達(dá)到 100 CFU/Test
所需其他材料和適用儀器：熒光定量 PCR 儀（具有能夠檢測(cè) FAM、VIC、Cy5、ROX 標(biāo)記的熒光通道）、高速離心機(jī)、移液器、移液槍頭及離心管等。
產(chǎn)腸毒素大腸埃希氏菌 ETEC核酸檢測(cè)試劑盒(PCR-熒光探針法)使用指南：
1，樣品前處理
1) 參照 GB 《4789.6?2016》，使用 1μL 接種環(huán)刮取新鮮培養(yǎng)的待鑒定的可疑菌落到含 30 μL 裂解液的無(wú)菌離心管中，充分懸浮菌體，輕彈管壁消除氣泡，99℃加熱 10 min；
2) 12000 r/min 離心 15 min，上清即為粗提的 DNA，可轉(zhuǎn)移至 0.2 mL 無(wú)菌離心管中，在-20℃下可長(zhǎng)期保存。也可以選擇商業(yè)化的細(xì)菌基因組提取試劑盒進(jìn)行提取。
2, 加樣、反應(yīng)
1) 按照需求取 n 個(gè) PCR 反應(yīng)管（n=1 管陰性對(duì)照+待檢測(cè)樣品數(shù)+1 管陽(yáng)性對(duì)照），從試劑盒中取出預(yù)混液，充分融化，渦旋后短暫離心，以上每管加入 20 μL 預(yù)混液，待用。
2) 向上述 n 個(gè)反應(yīng)管中分別加入陰性對(duì)照、待測(cè)樣品 DNA、陽(yáng)性對(duì)照各 5 μL，總反應(yīng)體積為 25 μL。蓋緊管蓋，短暫離心，立即進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增反應(yīng)。
3) PCR 反應(yīng)體系為 25 μL，取 FAM、VIC、Cy5、ROX 檢測(cè)通道，在反應(yīng)階段 2 中59℃時(shí)收集熒光信號(hào)，具體程序如下：
| 反應(yīng)階段 | 溫度 | 時(shí)間 | 信號(hào)收集 | 循環(huán)數(shù) |
| 1 | 95°C | 1 min | 1 | |
| 2 | 95°C | 10 sec | } 40 | |
| 59°C | 40 sec | ? |
注：在反應(yīng)階段 2 中 59℃時(shí)收集熒光信號(hào)，對(duì)于多通道熒光 PCR 儀，取熒光素 “FAM”、“VIC”、“Cy5”、“ROX”為信號(hào)采集通道，淬滅基團(tuán)選擇“None”，染料校正選擇“None”。
3, 結(jié)果：一般情況下，可通過軟件自動(dòng)設(shè)定的基線、閾值等直接讀取檢測(cè)結(jié)果。如需調(diào)整，可根據(jù)所使用儀器的自身情況（如噪聲等）以及選取的不同熒光通道進(jìn)行調(diào)整。
1) 質(zhì)量控制：陰性對(duì)照未出現(xiàn)明顯的 S 型擴(kuò)增曲線或 Ct 值＞37，陽(yáng)性對(duì)照出現(xiàn) S 型擴(kuò)增曲線且其 Ct 值＜30。若陰陽(yáng)性對(duì)照不同時(shí)滿足上述條件，則本次檢測(cè)結(jié)果無(wú)效，應(yīng)重新檢測(cè)或與產(chǎn)品技術(shù)支持聯(lián)系。
2) 結(jié)果判讀：（根據(jù)反應(yīng)所得 Ct 值判讀，具體見下表：）
| Ct值 | 判讀結(jié)果 |
| ≤35 | 對(duì)應(yīng)的基因陽(yáng)性。 |
| 35~37 | 建議重新檢測(cè)，若復(fù)測(cè)結(jié)果 Ct≥37，則對(duì)應(yīng)的基因陰性，反之為陽(yáng)性。 |
| ≥37 | 對(duì)應(yīng)的基因陰性。 |
? 一般豬源的 ST 基因和人源的 ST 基因在分離的菌株中只存在其中一種，特殊情況下除外。
? 陰性對(duì)照反應(yīng) 16S rRNA 基因可能會(huì)有弱陽(yáng)性現(xiàn)象，不作為陽(yáng)性結(jié)果判定依據(jù)。
? 多重 qPCR 檢測(cè)可能出現(xiàn)不同熒光通道之間競(jìng)爭(zhēng)抑制的問題，單基因分析時(shí)適當(dāng)調(diào)整閾值線。
