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細(xì)胞凍存和復(fù)蘇應(yīng)用領(lǐng)域
(1)用于生物學(xué)保種;(2)用于醫(yī)學(xué)上干細(xì)胞研究;(3)用于傳代培養(yǎng)。
細(xì)胞凍存和復(fù)蘇原理
細(xì)胞凍存及復(fù)蘇的基本原則是慢凍快融，實(shí)驗(yàn)證明這樣可以最大限度的保存細(xì)胞活力。目前細(xì)胞凍存多采用甘油或二甲基亞砜作保護(hù)劑，這兩種物質(zhì)能提高細(xì)胞膜對(duì)水的通透性，加上緩慢冷凍可使細(xì)胞內(nèi)的水分滲出細(xì)胞外，減少細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成，從而減少由于冰晶形成造成的細(xì)胞損傷。復(fù)蘇細(xì)胞應(yīng)采用快速融化的方法，這樣可以保證細(xì)胞外結(jié)晶在很短的時(shí)間內(nèi)即融化，避免由于緩慢融化使水分滲入細(xì)胞內(nèi)形成胞內(nèi)再結(jié)晶對(duì)細(xì)胞造成損傷。
主要材料
細(xì)胞
試劑、試劑盒：D-Hanks液 小牛血清 培養(yǎng)液 青霉素 鏈霉素 胰蛋白酶 HCl NaHCO3 DMSO 甘油
耗材設(shè)備：微量加樣槍 吸頭 離心管 凍存管 槍頭 膠塞 移液管玻璃瓶 紅血球計(jì)數(shù)板 記號(hào)筆 醫(yī)用橡皮膏 移液槍 超凈工作臺(tái) 離心機(jī) 恒溫水浴箱 冰箱 倒置相差顯微鏡 培養(yǎng)箱 液氮冰箱
步驟說明：
一、材料準(zhǔn)備
1. 儀器：凈化工作臺(tái)、 離心機(jī)、恒溫水浴箱、冰箱(4℃、-20℃、-70℃)、倒置相差顯微鏡、培養(yǎng)箱、液氮冰箱。
2. 玻璃器皿：吸管(彎頭、直頭)、 培養(yǎng)瓶、玻璃瓶(250ml、100ml)、廢液缸。
3. 塑料器皿： 吸頭、槍頭、膠塞、移液管(10ml)、15ml離心管、凍存管(1～2ml)。
注意事項(xiàng)
1. 從增殖期到形成致密的單層細(xì)胞以前的培養(yǎng)細(xì)胞都可以用于凍存，但最好為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞。在凍存前一天最好換一次培養(yǎng)液。
2. 將凍存管放入液氮容器或從中取出時(shí)，要做好防護(hù)工作，以免凍傷。
3. 凍存和復(fù)蘇最好用新配制的培養(yǎng)液。
細(xì)胞凍存和復(fù)蘇其他說明
一、凍存和復(fù)蘇的原則：慢凍快融
當(dāng)細(xì)胞冷到零度以下，可以產(chǎn)生以下變化：細(xì)胞器脫水，細(xì)胞中可溶性物質(zhì)濃度升高，并在細(xì)胞內(nèi)形成冰晶。
如果緩慢冷凍，可使細(xì)胞逐步脫水，細(xì)胞內(nèi)不致產(chǎn)生大的冰晶;相反，結(jié)晶就大，大結(jié)晶會(huì)造成細(xì)胞膜、綱胞器的損傷和破裂。復(fù)蘇過程應(yīng)快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重結(jié)晶。
二、慢凍程序
1. 標(biāo)準(zhǔn)程序：采用細(xì)胞凍存器
當(dāng)溫度在-25 ℃以上時(shí)， 1~2 ℃/min;
當(dāng)溫度達(dá)-25 ℃以下時(shí)， 5~10 ℃/min;
當(dāng)溫度達(dá)-100℃時(shí)，可迅速放入液氮中。
2. 簡(jiǎn)易程序：將冷凍管(管口要朝上)放入紗布袋內(nèi)，紗布袋系以線繩，通過線繩將紗布袋固定于液氮罐罐口，按每分鐘溫度下降1~2 ℃的速度，在40 min內(nèi)降至液氮表面過夜，次晨投人液氮中。
3. 傳統(tǒng)程序：冷凍管置于4℃ 10 分鐘→ -20℃ 30 分鐘→ -80℃ 16~18 小時(shí)(或隔夜) → 液氮槽長(zhǎng)期儲(chǔ)存。
三、低溫保護(hù)劑的應(yīng)用
在細(xì)胞凍存時(shí)加入溫保護(hù)劑，能大大提高凍存效果。
常用的低溫保護(hù)劑是DMSO，它是一種滲透性保護(hù)劑，可迅速透入細(xì)胞，提高胞膜對(duì)水的通透性，降低冰點(diǎn)，延緩凍結(jié)過程，能使細(xì)胞內(nèi)水分在凍結(jié)前透出細(xì)胞外，在胞外形成冰晶，減少胞內(nèi)冰晶，從而減少冰晶對(duì)細(xì)胞的損傷。
四、細(xì)胞凍存方法
1. 預(yù)先配制凍存液
(1)10%DMSO + 細(xì)胞生長(zhǎng)液(20%血清+基礎(chǔ)培養(yǎng)液)
(2)10%甘油+ 細(xì)胞生長(zhǎng)液(20%血清+基礎(chǔ)培養(yǎng)液)
2. 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化后，加入適量?jī)龃嬉海?用吸管吹打制成細(xì)胞懸液(1×106 ~ 5 ×106細(xì)胞/ml)。
3. 加入1 ml細(xì)胞于凍存管中，密封后標(biāo)記冷凍細(xì)胞名稱和冷凍日期。液氮長(zhǎng)期保存。
五、保存細(xì)胞的復(fù)蘇方法
1. 快速解凍
凍存細(xì)胞從液氮中取出后，立即放入37℃水浴中，輕輕搖動(dòng)冷凍管，使其在1 分鐘內(nèi)全部融化(不要超過3 分鐘)。
2. 解凍后的細(xì)胞可直接接種到含完全生長(zhǎng)培養(yǎng)液的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中直接進(jìn)行培養(yǎng)，24小時(shí)后再用新鮮完全培養(yǎng)液替換舊培養(yǎng)基液，以去除DMSO。
3. 如果細(xì)胞對(duì)冷凍保護(hù)劑特別敏感
解凍后的細(xì)胞應(yīng)先通過離心去除冷凍保護(hù)劑，然后再接種到含完全生長(zhǎng)培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中。
