甘油菌種復(fù)蘇保存步驟與注意事項(xiàng)
發(fā)布時(shí)間：2024-11-01 瀏覽次數(shù)：2295
在微生物學(xué)研究及其工業(yè)應(yīng)用中，甘油菌種的復(fù)蘇和保存尤為重要。甘油作為一種常用的保護(hù)劑，具有出色的維持菌種活性和穩(wěn)定性的能力。這一特點(diǎn)使其在微生物保存過(guò)程中得到了廣泛應(yīng)用。然而，復(fù)蘇和保存的細(xì)節(jié)及注意事項(xiàng)直接影響菌種的存活率以及后續(xù)實(shí)驗(yàn)的成功與否。因此，熟悉甘油菌種復(fù)蘇和保存的正確步驟與關(guān)鍵注意事項(xiàng)，對(duì)于檢測(cè)人員來(lái)說(shuō)，具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。
首先，甘油菌種的保存通常采用低溫冷凍的方法。將菌種與一定比例的甘油混合后，迅速冷凍至-80℃或更低的溫度，以確保菌種在低溫下的長(zhǎng)期穩(wěn)定性。在這個(gè)過(guò)程中，甘油的濃度、混合均勻性以及冷凍速度都是影響保存效果的重要因素。
其次，菌種的復(fù)蘇過(guò)程同樣需要精心操作。復(fù)蘇時(shí)，應(yīng)將冷凍的菌種迅速解凍，并在適宜的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。解凍過(guò)程中，溫度的控制和時(shí)間的把握至關(guān)重要，過(guò)快或過(guò)慢的解凍速度都可能導(dǎo)致菌種的損傷。此外，復(fù)蘇后的菌種應(yīng)盡快轉(zhuǎn)移到新鮮的培養(yǎng)基中，以恢復(fù)其生長(zhǎng)活性。
在整個(gè)復(fù)蘇和保存過(guò)程中，還需要注意無(wú)菌操作，避免外界污染對(duì)菌種的影響。同時(shí)，定期檢查保存的菌種，確保其活性和純度，也是保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠性的關(guān)鍵。
1.甘油菌種復(fù)蘇保存步驟
甘油菌種的復(fù)蘇保存是一個(gè)關(guān)鍵的過(guò)程，需要經(jīng)歷幾個(gè)重要步驟。首先，在菌種保存階段，應(yīng)將菌種接種于LB液體培養(yǎng)基，并在培養(yǎng)體系內(nèi)渾濁可見(jiàn)時(shí)進(jìn)行保存。接著，要準(zhǔn)備50%濃度的甘油溶液，確保在無(wú)菌條件下將菌液與甘油按1:1的比例混合，使甘油終濃度達(dá)到25%，然后保存在-20°C冰箱內(nèi)。
如果需要長(zhǎng)期保存，建議在-70°C或-80°C下凍存。在菌種復(fù)蘇階段，需要在30°C水浴中解凍保存的菌種，并接種到固體培養(yǎng)基上，在適宜條件下培養(yǎng)以恢復(fù)菌種的活性。最后，再次保存時(shí)，復(fù)蘇后的菌種可以在新的液體培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，并進(jìn)行甘油保存，以確保菌種的長(zhǎng)期保存和可用性。
在整個(gè)過(guò)程中需要注意的是，確保所有使用的工具和容器都經(jīng)過(guò)適當(dāng)?shù)臏缇幚?，保持無(wú)菌條件，以避免污染。正確的保存和復(fù)蘇方法對(duì)于保持菌種的活性和純度至關(guān)重要，且保存溫度對(duì)菌種的長(zhǎng)期存活有顯著影響，低溫有利于延長(zhǎng)保存時(shí)間。
甘油菌種的復(fù)蘇和保存的詳細(xì)的步驟及注意事項(xiàng)：
① 菌種保存步驟
準(zhǔn)備培養(yǎng)基：將菌種接種于LB液體培養(yǎng)基中，并在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期（培養(yǎng)體系內(nèi)渾濁可見(jiàn)時(shí)）進(jìn)行保存。
制備甘油溶液：準(zhǔn)備50%濃度的甘油溶液，可以通過(guò)等體積的蒸餾水和甘油混合得到。
混合菌液和甘油：在無(wú)菌條件下，將菌液與50%濃度的甘油按1:1的比例混合，使甘油終濃度達(dá)到25%。
保存菌種：將混合液轉(zhuǎn)移至2mL離心管中，并在-20°C冰箱內(nèi)保存。這種條件下，菌種的保存有效期為1年。若需長(zhǎng)期保存，建議在-70°C或-80°C下凍存，保藏時(shí)間一般為2-4年。
② 菌種復(fù)蘇步驟
解凍：在使用前，將保存的菌種在30°C水浴中解凍。
接種培養(yǎng)：解凍后，將菌液接種到固體培養(yǎng)基上，并在適宜條件下培養(yǎng)24-48小時(shí)，以恢復(fù)菌種的活性。
再次保存：復(fù)蘇后的菌種可以在新的液體培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，并再次進(jìn)行甘油保存。這一過(guò)程確保了菌種的長(zhǎng)期保存和可用性。
③ 注意事項(xiàng)
選擇合適的培養(yǎng)基：勿使用選擇性培養(yǎng)基。一般使用非選擇性的增菌培養(yǎng)基，因?yàn)槲⑸镌谶x擇性培養(yǎng)基中生長(zhǎng)某些生物特性可能丟失，保藏的菌種的生物特性可能與標(biāo)準(zhǔn)菌株特性不同。
菌液的濃度：菌液的濃度一般越大，菌種保存時(shí)間越長(zhǎng)。保藏時(shí)細(xì)菌常使用菌液，霉菌常用無(wú)菌水或生理鹽水制備成的孢子懸液。
甘油濃度：甘油終濃度一般為10%~20%。由于甘油原液太粘稠，需要配制合適的甘油-水溶液，將菌懸液與甘油以1:1的體積比充分混勻后，分裝至提前滅菌好的保藏管中，-80℃（-70℃）冰箱保存。
反復(fù)使用：對(duì)菌種進(jìn)行保藏時(shí)注意“慢凍快化”，冷凍時(shí)降溫速率保持1℃/min,復(fù)蘇時(shí)用37℃水浴融化，能夠保證菌種最大的成活率。當(dāng)冷凍菌種融化后，應(yīng)避免再次冷凍，否則菌體的生存率會(huì)大幅度降低。
保存時(shí)間：該方法適合中長(zhǎng)期菌種保藏，保藏時(shí)間一般為2-4年左右。
核查驗(yàn)證：每半年進(jìn)行一次菌種確認(rèn)試驗(yàn)，通過(guò)平板劃線(xiàn)分離、觀察菌落形態(tài)、染色鏡檢等常規(guī)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)菌的存活情況。若有條件，可用菌株生化鑒定試劑盒進(jìn)行確認(rèn)。
保存的溫度對(duì)菌種的長(zhǎng)期存活有很大影響，低溫條件有利于延長(zhǎng)保存時(shí)間。
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