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甘油菌種復(fù)蘇保存步驟與注意事項(xiàng)

發(fā)布時(shí)間:2024-11-01    瀏覽次數(shù):1190

在微生物學(xué)研究及其工業(yè)應(yīng)用中,甘油菌種的復(fù)蘇和保存尤為重要。甘油作為一種常用的保護(hù)劑,具有出色的維持菌種活性和穩(wěn)定性的能力。這一特點(diǎn)使其在微生物保存過程中得到了廣泛應(yīng)用。然而,復(fù)蘇和保存的細(xì)節(jié)及注意事項(xiàng)直接影響菌種的存活率以及后續(xù)實(shí)驗(yàn)的成功與否。因此,熟悉甘油菌種復(fù)蘇和保存的正確步驟與關(guān)鍵注意事項(xiàng),對于檢測人員來說,具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

首先,甘油菌種的保存通常采用低溫冷凍的方法。將菌種與一定比例的甘油混合后,迅速冷凍至-80℃或更低的溫度,以確保菌種在低溫下的長期穩(wěn)定性。在這個過程中,甘油的濃度、混合均勻性以及冷凍速度都是影響保存效果的重要因素。

其次,菌種的復(fù)蘇過程同樣需要精心操作。復(fù)蘇時(shí),應(yīng)將冷凍的菌種迅速解凍,并在適宜的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。解凍過程中,溫度的控制和時(shí)間的把握至關(guān)重要,過快或過慢的解凍速度都可能導(dǎo)致菌種的損傷。此外,復(fù)蘇后的菌種應(yīng)盡快轉(zhuǎn)移到新鮮的培養(yǎng)基中,以恢復(fù)其生長活性。

在整個復(fù)蘇和保存過程中,還需要注意無菌操作,避免外界污染對菌種的影響。同時(shí),定期檢查保存的菌種,確保其活性和純度,也是保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠性的關(guān)鍵。

1.甘油菌種復(fù)蘇保存步驟

甘油菌種的復(fù)蘇保存是一個關(guān)鍵的過程,需要經(jīng)歷幾個重要步驟。首先,在菌種保存階段,應(yīng)將菌種接種于LB液體培養(yǎng)基,并在培養(yǎng)體系內(nèi)渾濁可見時(shí)進(jìn)行保存。接著,要準(zhǔn)備50%濃度的甘油溶液,確保在無菌條件下將菌液與甘油按1:1的比例混合,使甘油終濃度達(dá)到25%,然后保存在-20°C冰箱內(nèi)。

如果需要長期保存,建議在-70°C或-80°C下凍存。在菌種復(fù)蘇階段,需要在30°C水浴中解凍保存的菌種,并接種到固體培養(yǎng)基上,在適宜條件下培養(yǎng)以恢復(fù)菌種的活性。最后,再次保存時(shí),復(fù)蘇后的菌種可以在新的液體培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng),并進(jìn)行甘油保存,以確保菌種的長期保存和可用性。

在整個過程中需要注意的是,確保所有使用的工具和容器都經(jīng)過適當(dāng)?shù)臏缇幚?,保持無菌條件,以避免污染。正確的保存和復(fù)蘇方法對于保持菌種的活性和純度至關(guān)重要,且保存溫度對菌種的長期存活有顯著影響,低溫有利于延長保存時(shí)間。

甘油菌種的復(fù)蘇和保存的詳細(xì)的步驟及注意事項(xiàng):

① 菌種保存步驟

準(zhǔn)備培養(yǎng)基:將菌種接種于LB液體培養(yǎng)基中,并在對數(shù)生長期(培養(yǎng)體系內(nèi)渾濁可見時(shí))進(jìn)行保存。
制備甘油溶液:準(zhǔn)備50%濃度的甘油溶液,可以通過等體積的蒸餾水和甘油混合得到。
混合菌液和甘油:在無菌條件下,將菌液與50%濃度的甘油按1:1的比例混合,使甘油終濃度達(dá)到25%。
保存菌種:將混合液轉(zhuǎn)移至2mL離心管中,并在-20°C冰箱內(nèi)保存。這種條件下,菌種的保存有效期為1年。若需長期保存,建議在-70°C或-80°C下凍存,保藏時(shí)間一般為2-4年。

② 菌種復(fù)蘇步驟

解凍:在使用前,將保存的菌種在30°C水浴中解凍。
接種培養(yǎng):解凍后,將菌液接種到固體培養(yǎng)基上,并在適宜條件下培養(yǎng)24-48小時(shí),以恢復(fù)菌種的活性。
再次保存:復(fù)蘇后的菌種可以在新的液體培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng),并再次進(jìn)行甘油保存。這一過程確保了菌種的長期保存和可用性。

③ 注意事項(xiàng)

選擇合適的培養(yǎng)基:勿使用選擇性培養(yǎng)基。一般使用非選擇性的增菌培養(yǎng)基,因?yàn)槲⑸镌谶x擇性培養(yǎng)基中生長某些生物特性可能丟失,保藏的菌種的生物特性可能與標(biāo)準(zhǔn)菌株特性不同。
菌液的濃度:菌液的濃度一般越大,菌種保存時(shí)間越長。保藏時(shí)細(xì)菌常使用菌液,霉菌常用無菌水或生理鹽水制備成的孢子懸液。
甘油濃度:甘油終濃度一般為10%~20%。由于甘油原液太粘稠,需要配制合適的甘油-水溶液,將菌懸液與甘油以1:1的體積比充分混勻后,分裝至提前滅菌好的保藏管中,-80℃(-70℃)冰箱保存。
反復(fù)使用:對菌種進(jìn)行保藏時(shí)注意“慢凍快化”,冷凍時(shí)降溫速率保持1℃/min,復(fù)蘇時(shí)用37℃水浴融化,能夠保證菌種最大的成活率。當(dāng)冷凍菌種融化后,應(yīng)避免再次冷凍,否則菌體的生存率會大幅度降低。
保存時(shí)間:該方法適合中長期菌種保藏,保藏時(shí)間一般為2-4年左右。
核查驗(yàn)證:每半年進(jìn)行一次菌種確認(rèn)試驗(yàn),通過平板劃線分離、觀察菌落形態(tài)、染色鏡檢等常規(guī)實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)菌的存活情況。若有條件,可用菌株生化鑒定試劑盒進(jìn)行確認(rèn)。

保存的溫度對菌種的長期存活有很大影響,低溫條件有利于延長保存時(shí)間。

定量菌株

文章來源:環(huán)凱轉(zhuǎn)載于“食品微生物檢測”公眾號;
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