實(shí)驗(yàn)干貨 | 原代細(xì)胞分離培養(yǎng)（小鼠結(jié)腸細(xì)胞為例）
發(fā)布時(shí)間：2024-02-22 瀏覽次數(shù)：1973
01 簡(jiǎn)介
原代細(xì)胞分離培養(yǎng)是一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)技術(shù)，它涉及從生物體中提取組織或細(xì)胞，并將它們轉(zhuǎn)移到體外環(huán)境中進(jìn)行培養(yǎng)。這些來(lái)源包括各種組織器官、外周血和胚胎等。在培養(yǎng)過(guò)程中，原代細(xì)胞的生長(zhǎng)速度相對(duì)較慢，通常在培養(yǎng)的前10代內(nèi)停止生長(zhǎng)。因此，通常將培養(yǎng)的細(xì)胞歸類為原代細(xì)胞培養(yǎng)，這些細(xì)胞包括第1到第10代的細(xì)胞。
原代細(xì)胞保持了體內(nèi)原始細(xì)胞的生物學(xué)特性，最接近于體內(nèi)的生長(zhǎng)特性。因此，它們?yōu)檠芯可矬w細(xì)胞的生長(zhǎng)、代謝和繁殖提供了有力的工具。此外，原代細(xì)胞培養(yǎng)還為精準(zhǔn)醫(yī)療的腫瘤診治模式和個(gè)體化精準(zhǔn)用藥提供了支持。
常見(jiàn)的原代細(xì)胞類型包括上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、角質(zhì)形成細(xì)胞、黑色素細(xì)胞、神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、肝細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、成骨細(xì)胞、肌細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、滑膜細(xì)胞、毛細(xì)胞、血細(xì)胞和干細(xì)胞。
02 實(shí)驗(yàn)原理
在原代細(xì)胞分離培養(yǎng)中，首先從動(dòng)物體內(nèi)取出各種組織，然后采用不同的方法，如酶消化（通常使用胰蛋白酶/膠原酶）、螯合劑（通常是EDTA）或機(jī)械分散，將組織分散成單個(gè)細(xì)胞。這些單細(xì)胞被放置在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，以在離體環(huán)境中存活、生長(zhǎng)和繁殖。這個(gè)過(guò)程稱為原代培養(yǎng)，主要包括取材、分離和培養(yǎng)三個(gè)步驟。
以小鼠結(jié)腸細(xì)胞為例，為了提高目標(biāo)細(xì)胞的純度，原代提取的細(xì)胞通常與其他細(xì)胞混合。通過(guò)采用生物酶梯度消化和差速貼壁等方法，可以獲得纖維組織和上皮組織的高純度目標(biāo)細(xì)胞。具體地，使用膠原酶 I 和分散酶 II 消化結(jié)腸組織可分散細(xì)胞間質(zhì)，而差異消化和差速貼壁方法則能有效去除成纖維細(xì)胞，最終獲得高度純凈的結(jié)腸上皮細(xì)胞。
03 材料與儀器
含有雙抗的DMEM培養(yǎng)基、5 g/L胰蛋白酶、Buffer溶液（5% RPMI1640 + 5% FBS + 10mM HEPES）、消化液（DMEM培養(yǎng)基溶解膠原酶I濃度為 0.1%，分散酶II濃度為 0.3%）、無(wú)菌剪刀、無(wú)菌鑷子、100 μm 細(xì)胞過(guò)濾器、細(xì)胞培養(yǎng)瓶、細(xì)胞培養(yǎng)板。
04 實(shí)驗(yàn)步驟
1. 通過(guò)使C57BL/6小鼠頸椎脫臼死亡，然后用適量的酒精噴灑和Buffer滴加的方式，快速分離結(jié)腸。
2. 沿著腸系膜進(jìn)行剪開，利用DMEM培養(yǎng)基清洗結(jié)腸，以去除其中的腸腔內(nèi)容物。
3. 使用無(wú)菌剪刀將結(jié)腸組織剪成約1mm3大小的碎片。
4. 使用10 mL 0.1%膠原酶I和3%分散酶II對(duì)組織進(jìn)行消化，在37℃的搖床上消化25分鐘。
5. 進(jìn)行吹打混勻，并通過(guò)100μm細(xì)胞過(guò)濾器過(guò)濾，以收集上清液。
6. 采用相差消化法和差速貼壁法去除成纖維細(xì)胞。
7. 加入1 mL培養(yǎng)基，將細(xì)胞懸浮后接種于含有完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，在37℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
8. 當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至培養(yǎng)瓶的80-90%時(shí)，使用5 g/L胰酶消化液進(jìn)行消化，然后將其接種于細(xì)胞培養(yǎng)板中。
05 「原代培養(yǎng)」注意事項(xiàng)與常見(jiàn)問(wèn)題
1.注意事項(xiàng)
原代細(xì)胞培養(yǎng)具有較高的成本，并對(duì)培養(yǎng)條件有嚴(yán)格要求。因此，在培養(yǎng)過(guò)程中需要特別注意保持無(wú)菌環(huán)境，并盡可能去除目標(biāo)細(xì)胞以外的其他細(xì)胞。
1.在實(shí)驗(yàn)開始前，必須對(duì)所有器械進(jìn)行消毒處理，并進(jìn)行高壓滅菌，液體則需要進(jìn)行無(wú)菌過(guò)濾處理。
2.酶消化液必須立即現(xiàn)用現(xiàn)配，以確保其活性。
3.在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，需要充分消化組織以確保檢測(cè)到足夠數(shù)量的細(xì)胞。
4.同時(shí)，也要盡可能充分去除成纖維細(xì)胞。
5.在后續(xù)的培養(yǎng)過(guò)程中，必須保持全程無(wú)菌操作，以確保培養(yǎng)環(huán)境的純凈性。
3.常見(jiàn)問(wèn)題
Q: 保存血清最好的方法是什么？
A: 建議將血清存放在 -5℃ 至 -20℃的溫度范圍內(nèi)。如果存放在4℃，請(qǐng)不要超過(guò)一個(gè)月。如果無(wú)法一次使用完整瓶血清，建議將血清經(jīng)過(guò)無(wú)菌分裝后存放在適當(dāng)?shù)臏缇萜髦?，然后再放回冷凍?/span>
Q: 如何解凍血清以保持其最佳培養(yǎng)狀態(tài)？
A: 建議將血清從冷凍箱中取出后，首先放置在2～8℃的冰箱中使其融化，然后在室溫下使其完全融化。但務(wù)必要注意，在融解過(guò)程中必須規(guī)律地?fù)u晃以確保均勻。
Q: 血清解凍后發(fā)現(xiàn)有絮狀沉淀物出現(xiàn)，應(yīng)該如何處理？
A: 血清中出現(xiàn)沉淀物有很多原因，但最常見(jiàn)的是由于血清中脂蛋白的變性所致。此外，血清解凍后血纖維蛋白的存在也可能導(dǎo)致沉淀物的生成。
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