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實驗干貨 | 原代細胞分離培養(yǎng)(小鼠結腸細胞為例)

發(fā)布時間:2024-02-22    瀏覽次數(shù):1976

01 簡介

原代細胞分離培養(yǎng)是一項實驗技術,它涉及從生物體中提取組織或細胞,并將它們轉移到體外環(huán)境中進行培養(yǎng)。這些來源包括各種組織器官、外周血和胚胎等。在培養(yǎng)過程中,原代細胞的生長速度相對較慢,通常在培養(yǎng)的前10代內停止生長。因此,通常將培養(yǎng)的細胞歸類為原代細胞培養(yǎng),這些細胞包括第1到第10代的細胞。

原代細胞保持了體內原始細胞的生物學特性,最接近于體內的生長特性。因此,它們?yōu)檠芯可矬w細胞的生長、代謝和繁殖提供了有力的工具。此外,原代細胞培養(yǎng)還為精準醫(yī)療的腫瘤診治模式和個體化精準用藥提供了支持。

常見的原代細胞類型包括上皮細胞、內皮細胞、成纖維細胞、角質形成細胞、黑色素細胞、神經(jīng)元、星形膠質細胞、肝細胞、骨骼肌細胞、平滑肌細胞、成骨細胞、肌細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、滑膜細胞、毛細胞、血細胞和干細胞。

原代細胞

02 實驗原理

在原代細胞分離培養(yǎng)中,首先從動物體內取出各種組織,然后采用不同的方法,如酶消化(通常使用胰蛋白酶/膠原酶)、螯合劑(通常是EDTA)或機械分散,將組織分散成單個細胞。這些單細胞被放置在適當?shù)呐囵B(yǎng)基中進行培養(yǎng),以在離體環(huán)境中存活、生長和繁殖。這個過程稱為原代培養(yǎng),主要包括取材、分離和培養(yǎng)三個步驟。

以小鼠結腸細胞為例,為了提高目標細胞的純度,原代提取的細胞通常與其他細胞混合。通過采用生物酶梯度消化和差速貼壁等方法,可以獲得纖維組織和上皮組織的高純度目標細胞。具體地,使用膠原酶 I 和分散酶 II 消化結腸組織可分散細胞間質,而差異消化和差速貼壁方法則能有效去除成纖維細胞,最終獲得高度純凈的結腸上皮細胞。

03 材料與儀器

 含有雙抗的DMEM培養(yǎng)基、5 g/L胰蛋白酶、Buffer溶液(5% RPMI1640 + 5% FBS + 10mM HEPES)、消化液(DMEM培養(yǎng)基溶解膠原酶I濃度為 0.1%,分散酶II濃度為 0.3%)、無菌剪刀、無菌鑷子、100 μm 細胞過濾器、細胞培養(yǎng)瓶、細胞培養(yǎng)板。

04 實驗步驟

1. 通過使C57BL/6小鼠頸椎脫臼死亡,然后用適量的酒精噴灑和Buffer滴加的方式,快速分離結腸。

2. 沿著腸系膜進行剪開,利用DMEM培養(yǎng)基清洗結腸,以去除其中的腸腔內容物。

3. 使用無菌剪刀將結腸組織剪成約1mm3大小的碎片。

4. 使用10 mL 0.1%膠原酶I和3%分散酶II對組織進行消化,在37℃的搖床上消化25分鐘。

5. 進行吹打混勻,并通過100μm細胞過濾器過濾,以收集上清液。

6. 采用相差消化法和差速貼壁法去除成纖維細胞。

7. 加入1 mL培養(yǎng)基,將細胞懸浮后接種于含有完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中,在37℃、5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

8. 當細胞生長至培養(yǎng)瓶的80-90%時,使用5 g/L胰酶消化液進行消化,然后將其接種于細胞培養(yǎng)板中。

05 「原代培養(yǎng)」注意事項與常見問題

1.注意事項

原代細胞培養(yǎng)具有較高的成本,并對培養(yǎng)條件有嚴格要求。因此,在培養(yǎng)過程中需要特別注意保持無菌環(huán)境,并盡可能去除目標細胞以外的其他細胞。

1.在實驗開始前,必須對所有器械進行消毒處理,并進行高壓滅菌,液體則需要進行無菌過濾處理。
2.酶消化液必須立即現(xiàn)用現(xiàn)配,以確保其活性。
3.在實驗過程中,需要充分消化組織以確保檢測到足夠數(shù)量的細胞。
4.同時,也要盡可能充分去除成纖維細胞。
5.在后續(xù)的培養(yǎng)過程中,必須保持全程無菌操作,以確保培養(yǎng)環(huán)境的純凈性。


3.常見問題

Q: 保存血清最好的方法是什么?
A: 建議將血清存放在 -5℃ 至 -20℃的溫度范圍內。如果存放在4℃,請不要超過一個月。如果無法一次使用完整瓶血清,建議將血清經(jīng)過無菌分裝后存放在適當?shù)臏缇萜髦?,然后再放回冷凍?/span>

Q: 如何解凍血清以保持其最佳培養(yǎng)狀態(tài)?
A: 建議將血清從冷凍箱中取出后,首先放置在2~8℃的冰箱中使其融化,然后在室溫下使其完全融化。但務必要注意,在融解過程中必須規(guī)律地搖晃以確保均勻。

Q: 血清解凍后發(fā)現(xiàn)有絮狀沉淀物出現(xiàn),應該如何處理?
A: 血清中出現(xiàn)沉淀物有很多原因,但最常見的是由于血清中脂蛋白的變性所致。此外,血清解凍后血纖維蛋白的存在也可能導致沉淀物的生成。


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