產(chǎn)品名稱：致病型唐菖蒲伯克霍爾德氏菌核酸檢測(cè)試劑盒(熒光探針?lè)?
英文名稱：Double PCR Detection Kit for Pathogenic Burkholderia gladioli(Fluorescent Probe Assays)
產(chǎn)品編號(hào)與包裝規(guī)格：
| 編號(hào) | 規(guī)格 |
|---|---|
| FZ024BF2 | 48 測(cè)試/盒 |
產(chǎn)品簡(jiǎn)介：本試劑盒僅適用于食品中唐菖蒲伯克霍爾德氏菌及其產(chǎn)米酵菌酸致病型菌株的定性檢測(cè)，毒性試驗(yàn)需另按照國(guó)標(biāo)《GB4789.29-2020 食品微生物學(xué)檢驗(yàn)-唐菖蒲伯克霍爾德氏菌（椰毒假單胞菌酵米面亞種）檢驗(yàn)》開(kāi)展。
檢測(cè)原理：基于Real Time PCR技術(shù)，利用針對(duì)于唐菖蒲伯克霍爾德氏菌特異性的結(jié)構(gòu)域蛋白基因和Bon毒力基因的雙重特異性引物、熒光探針以及其他反應(yīng)所需試劑，加入待檢樣品即可進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。在發(fā)生擴(kuò)增過(guò)程中，熒光探針與目的基因片段結(jié)合，可被Taq酶分解并產(chǎn)生熒光信號(hào)，此時(shí)熒光定量PCR儀可識(shí)別該熒光信號(hào)，同時(shí)根據(jù)其強(qiáng)弱變化繪制出相應(yīng)的實(shí)時(shí)擴(kuò)增曲線，進(jìn)而判定唐菖蒲伯克霍爾德氏菌是否檢出。
致病型唐菖蒲伯克霍爾德氏菌核酸檢測(cè)試劑盒(熒光探針?lè)?產(chǎn)品組分：
儲(chǔ)存條件與保質(zhì)期：-20℃避光儲(chǔ)存，有效期為12個(gè)月，避免反復(fù)凍融。
靈敏度：最低檢驗(yàn)限達(dá)到100 CFU/Test。
所需其他材料和適用儀器：熒光定量PCR儀（具有能夠檢測(cè)FAM標(biāo)記的熒光通道）、高速離心機(jī)、移液器、移液槍頭及離心管等。
致病型唐菖蒲伯克霍爾德氏菌核酸檢測(cè)試劑盒(熒光探針?lè)?使用指南：
1，樣品前處理
1）樣品增菌液模板DNA的制備：
a)、食品樣品，如新鮮銀耳、米面制品及其他食品，無(wú)菌操作稱取25g（mL）樣品，置入盛有225 mL GVC 增菌液的無(wú)菌均質(zhì)袋中（鮮銀耳樣品取1 g，用剪刀剪碎，加入盛有20 mL GVC 增菌液的無(wú)菌均質(zhì)袋中），用拍擊式均質(zhì)器拍打1 min~2 min；或置入盛有225 mL GVC 增菌液的無(wú)菌均質(zhì)杯中，以8000 r/min~10000 r/min均質(zhì)1 min~2 min若樣品為液態(tài)，振蕩混勻。將上述樣品增菌液置36℃±1℃培養(yǎng)20 h~24 h；
b)、取以上增菌液1 mL到1.5 mL規(guī)格的無(wú)菌離心管中，6000 r/min離心5 min，完全去除上清；
c)、加入30 μL裂解液充分懸浮管底沉淀，輕彈管壁消除氣泡，99℃加熱10 min。
d)、12000 r/min離心15 min，上清即為待測(cè)樣品DNA，靜置冰上，長(zhǎng)時(shí)間不用應(yīng)再次離心。
2）可疑菌落模板DNA的制備：
挑取可疑菌落，充分懸浮于預(yù)先加有30 μL裂解液的無(wú)菌離心管中，后按照上述步驟c)、d)操作。
2, 加樣、反應(yīng)
1) 按照需求取n個(gè)PCR反應(yīng)管（n=1管陰性對(duì)照+待檢測(cè)樣品數(shù)+1管陽(yáng)性對(duì)照），從試劑盒中取出預(yù)混液，充分融化，渦旋后短暫離心，以上每管加入20 μL預(yù)混液，待用。
2) 向上述n個(gè)反應(yīng)管中分別加入陰性對(duì)照、待測(cè)樣品DNA、陽(yáng)性對(duì)照各5 μL，總反應(yīng)體積為25 μL。蓋緊管蓋，短暫離心，立即進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。
3) PCR反應(yīng)體系為25 μL，取FAM、VIC檢測(cè)通道，在反應(yīng)階段2中60℃時(shí)收集熒光信號(hào)，具體程序如下：
注：在反應(yīng)階段2中60℃時(shí)收集熒光信號(hào)，對(duì)于多通道熒光PCR儀，取 “FAM”“VIC”為信號(hào)采集通道，淬滅基團(tuán)選擇“None”，染料校正選擇“None”。
3, 結(jié)果：一般情況下，可通過(guò)軟件自動(dòng)設(shè)定的基線、閾值等直接讀取檢測(cè)結(jié)果。如需調(diào)整，可根據(jù)所使用儀器的自身情況（如噪聲等）以及選取的不同熒光通道進(jìn)行調(diào)整。
1) 質(zhì)量控制：陰性對(duì)照未出現(xiàn)明顯的S型擴(kuò)增曲線或Ct值＞35，陽(yáng)性對(duì)照出現(xiàn)S型擴(kuò)增曲線且其Ct值＜30。若陰陽(yáng)性對(duì)照不同時(shí)滿足上述條件，則本次檢測(cè)結(jié)果無(wú)效，應(yīng)重新檢測(cè)或與產(chǎn)品技術(shù)支持聯(lián)系。
2) 結(jié)果判讀：（根據(jù)反應(yīng)所得Ct值判讀，具體見(jiàn)下表：）
產(chǎn)品使用注意事項(xiàng)：
1、實(shí)驗(yàn)環(huán)境條件和過(guò)程控制應(yīng)參照GB/T 27403《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范食品分子生物學(xué)檢測(cè)》規(guī)定執(zhí)行。
2、使用本試劑盒前請(qǐng)仔細(xì)閱讀本說(shuō)明書全文，檢測(cè)過(guò)程中建議穿潔凈工作服，戴一次性手套，使用的移液槍頭需提前滅菌。
3、試劑盒中試劑使用前需充分融化、混勻，短暫離心后使用，期間需盡量避免產(chǎn)生氣泡，加樣完畢后檢查反應(yīng)管是否蓋緊，避免泄露造成污染。
4、待檢測(cè)樣品基因變異可能會(huì)造成假陰性結(jié)果；待檢測(cè)樣品交叉污染、實(shí)驗(yàn)室環(huán)境污染以及試劑污染均會(huì)造成假陽(yáng)性結(jié)果。
5、不同批號(hào)的產(chǎn)品請(qǐng)勿混合使用，請(qǐng)?jiān)诋a(chǎn)品有效期內(nèi)使用試劑盒，由于操作不當(dāng)引起的誤判，以及由此誤判引發(fā)的其他事項(xiàng)，本公司概不負(fù)責(zé)。
6、檢測(cè)完畢后，根據(jù)相關(guān)規(guī)定正確處理廢棄耗材以及擴(kuò)增產(chǎn)物。
