方法

序號

現(xiàn)行標準

在意見稿中修改的內(nèi)容

修改說明

多

管

發(fā)

酵

法

1

設(shè)備材料規(guī)格不全或者同具體操作不對應

增加無菌試管規(guī)格35 mm×200 mm或其他適宜規(guī)格、無菌小倒管規(guī)格6 mm×30 mm、13 mm×100 mm或其它適宜規(guī)格；增加無菌吸管項代替現(xiàn)行無菌定量分裝器；增加pH計或pH比色管或精密pH試紙項；刪除電子天平、顯微鏡、電爐項。

一般性修訂：檢驗設(shè)備更加完善，且適用于具體操作步驟。

2

礦泉水水源水推測性檢測水樣量為10mL、1mL、0.1mL各5管。MPN表為總接種量為55.5mL對應的MPN表

礦泉水水源水檢測修改為15管發(fā)酵法，同時修改推測性檢測水樣量為100mL、10mL、1mL各5管。修改MPN表為總接種量為555mL對應的MPN表。

檢驗方法的重大修訂：增加檢測水樣量，減少由于水樣取樣量太少導致的結(jié)果不具有代表性，使結(jié)果更加準確。

3

直接飲用礦泉水檢測方法是5管MPN法，MPN表是5管MPN表

直接飲用礦泉水檢測方法修改為6管發(fā)酵法，在原標準的5管10mL接種量基礎(chǔ)上增加1管50mL接種到50mL雙料培養(yǎng)基步驟，共6管；修改對應MPN表從5管MPN表修訂為6管MPN表。

4

推測性實驗的培養(yǎng)時間為25h，確證性培養(yǎng)時間為48h

推測性實驗培養(yǎng)時間改為24±2h，確證性實驗培養(yǎng)時間改為48±2h。

一般性修訂：增加溫度范圍，修改更加合理。

5

確證實驗用到的亮綠乳糖膽鹽培養(yǎng)液(BGLB)的裝量沒有體現(xiàn)

明確亮綠乳糖膽鹽培養(yǎng)液的裝量為10mL。

一般性修訂：指定裝量，檢驗更明確。

濾

膜

法

6

設(shè)備材料不全

無菌濾膜修訂為無菌親水性微孔濾膜；無菌抽濾設(shè)備修訂為過濾設(shè)備；增加培養(yǎng)箱、顯微鏡、冰箱、pH計項目；培養(yǎng)基增加無菌生理鹽水、無菌磷酸鹽緩沖液、營養(yǎng)瓊脂項。

一般性修訂：材料設(shè)備更加全面，文字描述更加規(guī)范。

7

沒有濾膜法檢驗流程圖

增加濾膜法檢驗流程圖。

一般性修訂：檢驗流程表格化，清晰明白

8

沒有指定稀釋液種類

明確水樣稀釋液為無菌生理鹽水或者無菌磷酸鹽緩沖液。

一般性修訂：指定具體培養(yǎng)基，檢驗更明確。

9

濾膜法確證實驗挑取可疑菌落數(shù)為3個（不足3個全挑）

按比例挑取10個不同形態(tài)的可疑菌落（不足10個則全挑）。

較大修訂：增加確證實驗挑菌數(shù)，使結(jié)果更具代表性。

10

沒有菌落純培養(yǎng)過程

增加可疑菌落在營養(yǎng)瓊脂上的純培養(yǎng)過程。

一般性修訂：避免選擇性平板的菌落會影響生化鑒定結(jié)果；同時有助于分離出單菌落，便于下一步鑒定。

11

計算方法簡單

計算方法增加確證菌同可疑菌的比值，同時計入稀釋因子。

較大修訂：計算方法更加科學合理。

序號

現(xiàn)行標準

在意見稿中修改的內(nèi)容

修改說明

1

設(shè)備材料不全，表述不規(guī)范，培養(yǎng)基種類不全

無菌濾膜修改為無菌親水性微孔濾膜，無菌抽濾修訂為過濾設(shè)備，修改無菌刻度吸管項為無菌吸管，修改無菌培養(yǎng)皿為無菌平皿直徑：90mm；刪除無菌量筒、無菌試管、高壓蒸汽滅菌器、酒精燈項。冰箱溫度改為2-8℃；培養(yǎng)基腦-心浸萃液態(tài)培養(yǎng)基、腦-心浸萃瓊脂培養(yǎng)基修為腦心浸液液態(tài)培養(yǎng)基、腦心浸液瓊脂培養(yǎng)基；增加無菌生理鹽水、無菌磷酸鹽緩沖液、革蘭氏染色液、3%過氧化氫溶液、膽汁液態(tài)培養(yǎng)基。

一般性修訂：設(shè)備材料更加完善，文本表述更規(guī)范具體，補充整個實驗過程涉及到的培養(yǎng)基。

2

推測性實驗的培養(yǎng)時間為48h

推測性實驗培養(yǎng)時間改為48±2h。

一般性修訂：增加溫度范圍，修改更加合理。

3

濾膜法確證實驗挑取可疑菌落數(shù)為不少于5個（不足5個全挑）

按比例挑取10個不同形態(tài)的可疑菌落（不足10個則全挑）。

較大修訂：增加確證實驗挑菌數(shù)，使結(jié)果更具代表性。

4

直接挑取KF平板可疑菌落染色鏡檢

挑取KF平板可疑菌落在腦心浸液瓊脂平板后純培養(yǎng)后再染色鏡檢。

一般性修訂：純培養(yǎng)后的染色鏡檢結(jié)果更可靠，且方便后續(xù)的生化鑒定。

5

過氧化氫酶實驗沒有規(guī)定3%過氧化氫滴加量以及滴加后的氣泡觀察時間

明確滴加3%過氧化氫溶液2-3滴，同時觀察明確時間30s。

一般性修訂：明確具體檢驗。

6

用接種環(huán)從腦-心浸萃瓊脂培養(yǎng)基上轉(zhuǎn)移一環(huán)培養(yǎng)物到腦-心浸萃液態(tài)培養(yǎng)基內(nèi),在45 ℃培養(yǎng)48h。此外,也同時轉(zhuǎn)移一環(huán)培養(yǎng)物到膽汁液態(tài)培養(yǎng)基中

用接種環(huán)從腦心浸液瓊脂培養(yǎng)基平板上挑取單菌落到腦心浸液液態(tài)培養(yǎng)基內(nèi)，在45 ℃±1 ℃培養(yǎng)48 h±2 h。同時挑取單菌落到膽汁液態(tài)培養(yǎng)基中 。

一般性修訂：意見稿修改一環(huán)培養(yǎng)物為單菌落，同時增加溫度時間范圍，檢驗流程更加科學，表述更加規(guī)范。

7

結(jié)果報告沒有給出具體的計算方法

明確給出計算公式

較大修訂：計算公式更加科學。

序號

現(xiàn)行標準

在意見稿中修改的內(nèi)容

修改說明

1

設(shè)備材料方面不全

增加“無菌濾器、過濾設(shè)備、無菌無齒鑷子、無菌平皿、pH 計或 pH 比色管或精密 pH 試紙”。

一般性修訂：檢驗設(shè)備更詳盡。

2

銅綠假單胞菌未指明具體的水樣稀釋液

水樣稀釋液明確為“無菌生理鹽水”或“無菌磷酸鹽緩沖液”。

明確稀釋液及強調(diào)無菌要求。

3

可疑菌落分別計數(shù)后，沒有明確是否需接種營養(yǎng)瓊脂純化后再做生化確證

明確了可疑菌落計數(shù)后接種營養(yǎng)瓊脂分純培養(yǎng)后，再進行生化試驗。

一般性修訂：分純一方面方便可疑菌落的保存，另一方面分純后的可疑菌落是經(jīng)過擴繁的，后續(xù)生化實驗不用擔心可疑菌落不夠用或者接種量少影響試驗結(jié)果。

4

未明確哪些可疑菌落需進行綠膿菌素試驗確證

明確只是濾膜上所有顯藍色和綠色的菌落需進行綠膿菌素試驗確證。

一般性修訂：在CN上非藍/綠色菌落，不一定產(chǎn)綠膿菌素特征，所以明確綠膿菌素確證只是針對藍/綠色菌落。

5

發(fā)熒光非藍色或非綠色菌落需進行產(chǎn)氨試驗確證。

發(fā)熒光非藍色或非綠色菌落除了做產(chǎn)氨試驗外，還增加了42℃生長試驗。

較大修訂：由于熒光假單胞菌42℃不生長，因此，該試驗可區(qū)分熒光假單胞菌和銅綠假單胞菌。

6

在100級潔凈工作臺進行過濾操作

刪除在100級潔凈工作臺進行過濾操作的要求。

一般性修訂：由于過濾操作需潔凈環(huán)境操作即可，且過濾系統(tǒng)放在超凈工作臺中，不方便操作，因此，不強制要求在100級潔凈工作臺進行過濾操作。

7

CN瓊脂培養(yǎng)時間：24-48h

CN瓊脂培養(yǎng)時間修改為20-48h。

一般性修訂

8

產(chǎn)氨試驗無觀察時間要求

產(chǎn)氨試驗，明確添加鈉氏試劑需10s內(nèi)觀察結(jié)果。

一般性修訂：滴加試劑后，延長觀察時間會有假陽性。

9

菌落計算公式

菌落計算公式修改為

較大修訂：根據(jù)確證試驗項目修改進行相應的修改。

10

陰性對照菌株為熒光假單胞菌

陰性對照菌株更改為惡臭假單胞菌。

較大修訂：部分熒光假單胞菌在37℃的條件下不生長。

序號

現(xiàn)行標準

在意見稿中修改的內(nèi)容

修改說明

1

設(shè)備材料：濾膜孔徑：0.22μm

方法提要：濾膜孔徑：0.45μm

濾膜孔徑：0.45μm

一般性修訂：明確濾膜孔徑為0.45μm ，GB 8538各菌檢驗使用0.45μm規(guī)格的濾膜即可完成GB 8538的各項微生物檢驗。

2

計數(shù)培養(yǎng)基：SPS

計數(shù)培養(yǎng)基：TSC

檢驗方法的重大修訂：TSC為GB 4789及FDA檢驗產(chǎn)氣莢膜梭菌所采用的培養(yǎng)基，與SPS相比，產(chǎn)氣莢膜梭菌在TSC上產(chǎn)生黑色中心的效果優(yōu)于SPS。

3

過濾完成后濾膜放置于培養(yǎng)基后即可培養(yǎng)

過濾完成后新增操作：傾注5 mL-10 mL冷卻至50℃的TSC瓊脂均勻覆蓋濾膜表面。

檢驗方法的重大修訂：傾注一層薄培養(yǎng)基覆蓋濾膜不影響菌落挑取，菌落處于培養(yǎng)基內(nèi)部的話，菌落產(chǎn)黑的特征更優(yōu)。

4

確證試驗包含卵磷脂分解試驗

確證實驗刪除卵磷脂分解試驗，增加了乳糖-明膠試驗。

檢驗方法的重大修訂：部分巴氏梭菌在含鐵牛奶培養(yǎng)基上也呈暴烈發(fā)酵的現(xiàn)象，乳糖明膠試驗可以區(qū)分。此外，一些產(chǎn)氣莢膜梭菌磷脂酶活性較弱，可能會造成卵磷脂分解試驗假陰性的情況。

5

陰性對照菌株：絕對厭氧菌

陰性對照菌株：艱難梭菌

較大修訂：絕對厭氧菌株包含艱難梭菌、生孢梭菌等多種菌株，修改后明確為艱難梭菌，給予了實驗人員明確的指示。

6

無計算公式

結(jié)果報告新增計算公式

一般性修訂。

7

培養(yǎng)基和試劑：

動力-硝酸鹽培養(yǎng)基(B法)

動力-硝酸鹽培養(yǎng)基(B法)

確證實驗：動力-硝酸鹽培養(yǎng)基

培養(yǎng)基和試劑：緩沖動力硝酸鹽

確證實驗：明確動力試驗及硝酸鹽還原試驗采用緩沖動力硝酸鹽培養(yǎng)基，新增操作“如果不出現(xiàn)顏色變化，則加少許鋅粉，放置 10 min，出現(xiàn)紅色者，表明該菌株不能還原硝酸鹽。

一般性修訂。

8

可疑菌落的挑取數(shù)量：3-5個

可疑菌落的挑取數(shù)量：按比例挑取 10 個不同形態(tài)的可疑菌落（不足 10 個則全挑）。

較大修訂：增加確證菌落數(shù)。