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GB 8538飲用天然礦泉水檢驗方法 征求意見稿(微生物檢驗方法)

發(fā)布時間:2020-10-20    瀏覽次數(shù):7793

      8月31日下午,國家衛(wèi)健委發(fā)布《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)審評委員會秘書處關(guān)于征求食品中污染物限量等16項食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)(征求意見稿)意見的函》。其中GB8538征求意見稿對現(xiàn)行礦泉水標(biāo)準(zhǔn)的微生物部分做了大量的補充和修正,比如:提及的培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時間缺少波動范圍,檢驗方法中列出的設(shè)備與材料、培養(yǎng)基和試劑內(nèi)容與操作步驟中提到的不一致,檢測程序圖與操作步驟不一致;附錄 A:標(biāo)題與內(nèi)容不完全對應(yīng),培養(yǎng)基 pH 值缺少波動范圍, 部分培養(yǎng)基成分錯誤等問題; 附錄 B: 表 B.1 中微生物測定項目有誤,且微生物檢樣采樣體積不符合要求。涉及大腸菌群、糞鏈球菌、銅綠假單胞菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌4個微生物檢測項目。

      下面我們把微生物檢驗各檢測項目的修訂情況匯總,如下表1/2/3/4:

表1 大腸菌群檢驗

方法

序號

現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)

在意見稿中修改的內(nèi)容

修改說明

發(fā)

1

設(shè)備材料規(guī)格不全或者同具體操作不對應(yīng)

增加無菌試管規(guī)格35 mm×200 mm或其他適宜規(guī)格、無菌小倒管規(guī)格6 mm×30 mm、13 mm×100 mm或其它適宜規(guī)格;增加無菌吸管項代替現(xiàn)行無菌定量分裝器;增加pH計或pH比色管或精密pH試紙項;刪除電子天平、顯微鏡、電爐項。

一般性修訂:檢驗設(shè)備更加完善,且適用于具體操作步驟。

2

礦泉水水源水推測性檢測水樣量為10mL、1mL、0.1mL各5管。MPN表為總接種量為55.5mL對應(yīng)的MPN表

礦泉水水源水檢測修改為15管發(fā)酵法,同時修改推測性檢測水樣量為100mL、10mL、1mL各5管。修改MPN表為總接種量為555mL對應(yīng)的MPN表。

檢驗方法的重大修訂:增加檢測水樣量,減少由于水樣取樣量太少導(dǎo)致的結(jié)果不具有代表性,使結(jié)果更加準(zhǔn)確。

3

直接飲用礦泉水檢測方法是5管MPN法,MPN表是5管MPN表

直接飲用礦泉水檢測方法修改為6管發(fā)酵法,在原標(biāo)準(zhǔn)的5管10mL接種量基礎(chǔ)上增加1管50mL接種到50mL雙料培養(yǎng)基步驟,共6管;修改對應(yīng)MPN表從5管MPN表修訂為6管MPN表。

4

推測性實驗的培養(yǎng)時間為25h,確證性培養(yǎng)時間為48h

推測性實驗培養(yǎng)時間改為24±2h,確證性實驗培養(yǎng)時間改為48±2h。

一般性修訂:增加溫度范圍,修改更加合理。

5

確證實驗用到的亮綠乳糖膽鹽培養(yǎng)液(BGLB)的裝量沒有體現(xiàn)

明確亮綠乳糖膽鹽培養(yǎng)液的裝量為10mL。

一般性修訂:指定裝量,檢驗更明確。

6

設(shè)備材料不全

無菌濾膜修訂為無菌親水性微孔濾膜;無菌抽濾設(shè)備修訂為過濾設(shè)備;增加培養(yǎng)箱、顯微鏡、冰箱、pH計項目;培養(yǎng)基增加無菌生理鹽水、無菌磷酸鹽緩沖液、營養(yǎng)瓊脂項。

一般性修訂:材料設(shè)備更加全面,文字描述更加規(guī)范。

7

沒有濾膜法檢驗流程圖

增加濾膜法檢驗流程圖。

一般性修訂:檢驗流程表格化,清晰明白

8

沒有指定稀釋液種類

明確水樣稀釋液為無菌生理鹽水或者無菌磷酸鹽緩沖液。

一般性修訂:指定具體培養(yǎng)基,檢驗更明確。

9

濾膜法確證實驗挑取可疑菌落數(shù)為3個(不足3個全挑)

按比例挑取10個不同形態(tài)的可疑菌落(不足10個則全挑)。

較大修訂:增加確證實驗挑菌數(shù),使結(jié)果更具代表性。

10

沒有菌落純培養(yǎng)過程

增加可疑菌落在營養(yǎng)瓊脂上的純培養(yǎng)過程。

一般性修訂:避免選擇性平板的菌落會影響生化鑒定結(jié)果;同時有助于分離出單菌落,便于下一步鑒定。

11

計算方法簡單

計算方法增加確證菌同可疑菌的比值,同時計入稀釋因子。

較大修訂:計算方法更加科學(xué)合理。

表2 糞鏈球菌檢驗

序號

現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)

在意見稿中修改的內(nèi)容

修改說明

1

設(shè)備材料不全,表述不規(guī)范,培養(yǎng)基種類不全

無菌濾膜修改為無菌親水性微孔濾膜,無菌抽濾修訂為過濾設(shè)備,修改無菌刻度吸管項為無菌吸管,修改無菌培養(yǎng)皿為無菌平皿直徑:90mm;刪除無菌量筒、無菌試管、高壓蒸汽滅菌器、酒精燈項。冰箱溫度改為2-8℃;培養(yǎng)基腦-心浸萃液態(tài)培養(yǎng)基、腦-心浸萃瓊脂培養(yǎng)基修為腦心浸液液態(tài)培養(yǎng)基、腦心浸液瓊脂培養(yǎng)基;增加無菌生理鹽水、無菌磷酸鹽緩沖液、革蘭氏染色液、3%過氧化氫溶液、膽汁液態(tài)培養(yǎng)基。

一般性修訂:設(shè)備材料更加完善,文本表述更規(guī)范具體,補充整個實驗過程涉及到的培養(yǎng)基。

2

推測性實驗的培養(yǎng)時間為48h

推測性實驗培養(yǎng)時間改為48±2h。

一般性修訂:增加溫度范圍,修改更加合理。

3

濾膜法確證實驗挑取可疑菌落數(shù)為不少于5個(不足5個全挑)

按比例挑取10個不同形態(tài)的可疑菌落(不足10個則全挑)。

較大修訂:增加確證實驗挑菌數(shù),使結(jié)果更具代表性。

4

直接挑取KF平板可疑菌落染色鏡檢

挑取KF平板可疑菌落在腦心浸液瓊脂平板后純培養(yǎng)后再染色鏡檢。

一般性修訂:純培養(yǎng)后的染色鏡檢結(jié)果更可靠,且方便后續(xù)的生化鑒定。

5

過氧化氫酶實驗沒有規(guī)定3%過氧化氫滴加量以及滴加后的氣泡觀察時間

明確滴加3%過氧化氫溶液2-3滴,同時觀察明確時間30s。

一般性修訂:明確具體檢驗。

6

用接種環(huán)從腦-心浸萃瓊脂培養(yǎng)基上轉(zhuǎn)移一環(huán)培養(yǎng)物到腦-心浸萃液態(tài)培養(yǎng)基內(nèi),在45 ℃培養(yǎng)48h。此外,也同時轉(zhuǎn)移一環(huán)培養(yǎng)物到膽汁液態(tài)培養(yǎng)基中

用接種環(huán)從腦心浸液瓊脂培養(yǎng)基平板上挑取單菌落到腦心浸液液態(tài)培養(yǎng)基內(nèi),在45 ℃±1 ℃培養(yǎng)48 h±2 h。同時挑取單菌落到膽汁液態(tài)培養(yǎng)基中 。

一般性修訂:意見稿修改一環(huán)培養(yǎng)物為單菌落,同時增加溫度時間范圍,檢驗流程更加科學(xué),表述更加規(guī)范。

7

結(jié)果報告沒有給出具體的計算方法

明確給出計算公式

較大修訂:計算公式更加科學(xué)。

表3 銅綠假單胞菌檢驗

序號

現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)

在意見稿中修改的內(nèi)容

修改說明

1

設(shè)備材料方面不全

增加“無菌濾器、過濾設(shè)備、無菌無齒鑷子、無菌平皿、pH 計或 pH 比色管或精密 pH 試紙”。

一般性修訂:檢驗設(shè)備更詳盡。

2

銅綠假單胞菌未指明具體的水樣稀釋液

水樣稀釋液明確為“無菌生理鹽水”或“無菌磷酸鹽緩沖液”。

明確稀釋液及強調(diào)無菌要求。

3

可疑菌落分別計數(shù)后,沒有明確是否需接種營養(yǎng)瓊脂純化后再做生化確證

明確了可疑菌落計數(shù)后接種營養(yǎng)瓊脂分純培養(yǎng)后,再進(jìn)行生化試驗。

一般性修訂:分純一方面方便可疑菌落的保存,另一方面分純后的可疑菌落是經(jīng)過擴(kuò)繁的,后續(xù)生化實驗不用擔(dān)心可疑菌落不夠用或者接種量少影響試驗結(jié)果。

4

未明確哪些可疑菌落需進(jìn)行綠膿菌素試驗確證

明確只是濾膜上所有顯藍(lán)色和綠色的菌落需進(jìn)行綠膿菌素試驗確證。

一般性修訂:在CN上非藍(lán)/綠色菌落,不一定產(chǎn)綠膿菌素特征,所以明確綠膿菌素確證只是針對藍(lán)/綠色菌落。

5

發(fā)熒光非藍(lán)色或非綠色菌落需進(jìn)行產(chǎn)氨試驗確證。

發(fā)熒光非藍(lán)色或非綠色菌落除了做產(chǎn)氨試驗外,還增加了42℃生長試驗。

較大修訂:由于熒光假單胞菌42℃不生長,因此,該試驗可區(qū)分熒光假單胞菌和銅綠假單胞菌。

6

在100級潔凈工作臺進(jìn)行過濾操作

刪除在100級潔凈工作臺進(jìn)行過濾操作的要求。

一般性修訂:由于過濾操作需潔凈環(huán)境操作即可,且過濾系統(tǒng)放在超凈工作臺中,不方便操作,因此,不強制要求在100級潔凈工作臺進(jìn)行過濾操作。

7

CN瓊脂培養(yǎng)時間:24-48h

CN瓊脂培養(yǎng)時間修改為20-48h。

一般性修訂

8

產(chǎn)氨試驗無觀察時間要求

產(chǎn)氨試驗,明確添加鈉氏試劑需10s內(nèi)觀察結(jié)果。

一般性修訂:滴加試劑后,延長觀察時間會有假陽性。

9

菌落計算公式

菌落計算公式修改為

較大修訂:根據(jù)確證試驗項目修改進(jìn)行相應(yīng)的修改。

10

陰性對照菌株為熒光假單胞菌

陰性對照菌株更改為惡臭假單胞菌。

較大修訂:部分熒光假單胞菌在37℃的條件下不生長。

表4 產(chǎn)氣莢膜梭菌檢驗

序號

現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)

在意見稿中修改的內(nèi)容

修改說明

1

設(shè)備材料:濾膜孔徑:0.22μm

方法提要:濾膜孔徑:0.45μm

濾膜孔徑:0.45μm

一般性修訂:明確濾膜孔徑為0.45μm ,GB 8538各菌檢驗使用0.45μm規(guī)格的濾膜即可完成GB 8538的各項微生物檢驗。

2

計數(shù)培養(yǎng)基:SPS

計數(shù)培養(yǎng)基:TSC

檢驗方法的重大修訂:TSC為GB 4789及FDA檢驗產(chǎn)氣莢膜梭菌所采用的培養(yǎng)基,與SPS相比,產(chǎn)氣莢膜梭菌在TSC上產(chǎn)生黑色中心的效果優(yōu)于SPS。

3

過濾完成后濾膜放置于培養(yǎng)基后即可培養(yǎng)

過濾完成后新增操作:傾注5 mL-10 mL冷卻至50℃的TSC瓊脂均勻覆蓋濾膜表面。

檢驗方法的重大修訂:傾注一層薄培養(yǎng)基覆蓋濾膜不影響菌落挑取,菌落處于培養(yǎng)基內(nèi)部的話,菌落產(chǎn)黑的特征更優(yōu)。

4

確證試驗包含卵磷脂分解試驗

確證實驗刪除卵磷脂分解試驗,增加了乳糖-明膠試驗。

檢驗方法的重大修訂:部分巴氏梭菌在含鐵牛奶培養(yǎng)基上也呈暴烈發(fā)酵的現(xiàn)象,乳糖明膠試驗可以區(qū)分。此外,一些產(chǎn)氣莢膜梭菌磷脂酶活性較弱,可能會造成卵磷脂分解試驗假陰性的情況。

5

陰性對照菌株:絕對厭氧菌

陰性對照菌株:艱難梭菌

較大修訂:絕對厭氧菌株包含艱難梭菌、生孢梭菌等多種菌株,修改后明確為艱難梭菌,給予了實驗人員明確的指示。

6

無計算公式

結(jié)果報告新增計算公式

一般性修訂。

7

培養(yǎng)基和試劑:

動力-硝酸鹽培養(yǎng)基(B法)

動力-硝酸鹽培養(yǎng)基(B法)

確證實驗:動力-硝酸鹽培養(yǎng)基

培養(yǎng)基和試劑:緩沖動力硝酸鹽

確證實驗:明確動力試驗及硝酸鹽還原試驗采用緩沖動力硝酸鹽培養(yǎng)基,新增操作“如果不出現(xiàn)顏色變化,則加少許鋅粉,放置 10 min,出現(xiàn)紅色者,表明該菌株不能還原硝酸鹽。

一般性修訂。

8

可疑菌落的挑取數(shù)量:3-5個

可疑菌落的挑取數(shù)量:按比例挑取 10 個不同形態(tài)的可疑菌落(不足 10 個則全挑)。

較大修訂:增加確證菌落數(shù)。

大腸菌群檢驗用培養(yǎng)基試劑列表

方法

貨號

名稱

類別

規(guī)格

配制量 g/L

單瓶/盒可配制液體量 L

多管發(fā)酵法

CP0311D

單料乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基

試管(盒)

10ml×20/

CP0311A

雙料乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基

試管(盒)

10ml×20/

022040

乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基

干粉(瓶)

250g

35

單料7.14

雙料3.57

022040P1

乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基(顆粒型)

顆粒(瓶)

250g

35

單料7.14

雙料3.57

022190

亮綠乳糖膽鹽培養(yǎng)液(BGLB)

干粉(瓶)

250g

40

6.25

濾膜法

022117

磷酸鹽緩沖液

干粉(瓶)

250g

41

4872

022150

遠(yuǎn)藤瓊脂培養(yǎng)基(品紅亞硫酸鈉培養(yǎng)基)

干粉(瓶)

 250g

54.5

4.59

C22200G1

單料乳糖蛋白胨發(fā)酵管

試管(盒)

10ml×20/

022200

乳糖蛋白胨培養(yǎng)液

干粉(瓶)

 250g

23

10.86

022020

營養(yǎng)瓊脂

干粉(瓶)

250g

33

7.57

024089

營養(yǎng)瓊脂平板

盒(平板)

90 mm×20

029010

革蘭氏染色液

檢測配套試劑(盒)

10ml×4/

糞鏈球菌檢驗用培養(yǎng)基試劑列表

貨號

名稱

類別

規(guī)格

配制量 g/L

單瓶/盒可配制液體量 L

028350

KF鏈球菌瓊脂培養(yǎng)基

干粉(瓶)

100g

71.5

1.39

024053P1

腦心浸出液肉湯(顆粒型)

顆粒(瓶)

100g

36

2.77

024053A

腦心浸出液肉湯BHI

試管(盒)

10ml×20/

024053

腦心浸出液肉湯(BHI)

干粉(瓶)

100g

36

2.77

029161

3%過氧化氫溶液

生化管(盒)

10/

028365

膽汁液態(tài)培養(yǎng)基

干粉(瓶)

100g

41

2.43

022020

營養(yǎng)瓊脂

干粉(瓶)

250g

33

7.57

024089

營養(yǎng)瓊脂平板

盒(平板)

90 mm×20

029010

革蘭氏染色液

檢測配套試劑(盒)

10ml×4/

ATCC 29212

糞鏈球菌

凍干菌株

ATCC 25922

大腸埃希氏菌

凍干菌株

銅綠假單胞菌檢驗用培養(yǎng)基試劑列表

貨號

名稱

類別

規(guī)格

配制量 g/L

單瓶/盒可配制液體量 L

027053

假單胞菌瓊脂基礎(chǔ)培養(yǎng)基(CN瓊脂)

干粉(瓶)

250g

52.6 g/L

4.75

SR0230

萘啶酮酸(CN瓊脂配套試劑)

生化管(盒)

10/

每支添加于100 mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基中

1.00

027054

假單胞菌瓊脂基礎(chǔ)培養(yǎng)基(CN瓊脂)

已包含萘啶酮酸產(chǎn)品

干粉(瓶)

250g

52.6 g/L

4.75

029080

甘油(CN瓊脂需添加配套試劑)

生化管(盒)

10/

每支加于100 mL CN瓊脂基礎(chǔ)培養(yǎng)基中

1.00

CP0420

假單胞菌瓊脂(CN瓊脂)平板

成品(平板)

90 mm×20

027052

金氏B培養(yǎng)基

干粉(瓶)

250g

38 g/L

6.58

029080

甘油(金氏B需添加配套試劑)

生化管(盒)

10/

每支添加于100 mL金氏B基礎(chǔ)培養(yǎng)基中

1.00

022020

營養(yǎng)瓊脂

干粉(瓶)

250g

33g/L

7.57

024089

營養(yǎng)瓊脂平板

盒(平板)

90 mm×20

075800

乙酰胺肉湯

生化管(盒)

20/

029229

納氏試劑

檢測配套試劑(盒)

029170

氧化酶試紙

生化管(盒)

10/

產(chǎn)氣莢膜梭菌檢驗用培養(yǎng)基試劑列表

貨號

名稱

類別

規(guī)格

配制量 g/L

單瓶/盒可配制液體量 L

028020

胰胨-亞硫酸鹽-環(huán)絲氨酸瓊脂基礎(chǔ)(TSC)

干粉(瓶)

100g

42.0

2.38

SR0290

胰胨-亞硫酸鹽-環(huán)絲氨酸瓊脂基礎(chǔ)(TSC)脂配套試劑

檢測配套試劑(盒)

10/

100ml1

1.00

028030

液體硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基(FT)

干粉(瓶)

250g

29.3

8.53

075810

緩沖動力-硝酸鹽

生化管(盒)

20/

029070

硝酸鹽還原試劑(甲液:對氨基苯磺酸)(乙液:甲萘胺)

檢測配套試劑(盒)

10ml×2/

075850

乳糖明膠

生化管(盒)

20/

028035

含鐵牛奶培養(yǎng)基

干粉(瓶)

250g

200

1.25

028025

0.1%蛋白胨水

干粉(瓶)

250g

1

250

029010

革蘭氏染色液

檢測配套試劑(盒)

10ml×4/




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