微生物實驗室如果從事致病菌檢測、培養(yǎng)基質控驗收、方法驗證等相關工作，就應該備有質控菌株。實驗室需對使用的質控菌株進行規(guī)范性管理，以便有效地、安全地使用，保證實驗結果的準確性，今天我們從凍干菌種的復蘇確認、質控菌種的保藏和使用、菌種管理要求、菌種接收和登記四個方面為大家詳解實驗室質控菌種保藏、使用及管理。

一、凍干菌株的復蘇確認

1、圖解凍干菌株復蘇具體操作

準備開啟復蘇凍干菌種的所有實驗用品：酒精燈、75%消毒酒精棉、移液槍、接種環(huán)、培養(yǎng)基、凍干菌種（注意：所有操作應在符合生物安全保護及無菌條件下進行）

開啟凍干菌種西林瓶時，用75%酒精棉消毒西林瓶表面。

然后，在無菌條件下，按鋁蓋上的箭頭方向打開塑蓋，撕開鋁蓋，打開西林瓶膠塞。

用移液槍向凍干質控菌種西林瓶加入0.3ml左右的配套液體培養(yǎng)基，水化凍干粉，將凍干質控菌種溶解成為均勻的懸液。

用移液槍吸取適量凍干粉水化懸液，移至適合其生長的斜面、平板或液體培養(yǎng)基上。

或者，用接種環(huán)蘸取適量凍干粉水化懸液。

接種斜面

或平板劃線接種（便于觀察菌落形態(tài)）

接種完后，在器皿上標記菌種編號、傳代數、日期等信息。

倒置放進恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

最后，將轉接的斜面或平板以及西林瓶里剩余的菌懸液放置于36°C培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)

次日，觀察菌種的生長情況，如未生長，應繼續(xù)培養(yǎng)24H，或吸取西林瓶里的懸液再次接種斜面或平板培養(yǎng)基，培養(yǎng)24H觀察。

2、凍干菌株復蘇補充說明

1）志賀氏菌、阪崎腸桿菌、肺炎克雷伯氏菌、陰溝腸桿菌、產氣腸桿菌、奇異變形桿菌、普通變形桿菌、小腸結腸炎耶爾森氏菌、粘質沙雷伯氏菌、弗氏檸檬酸桿菌、銅綠假單胞菌、芽孢桿菌類、大腸埃希氏菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、藤黃微球菌：復蘇水化液為腦心浸液培養(yǎng)基，復蘇培養(yǎng)基為營養(yǎng)瓊脂，復蘇培養(yǎng)條件37±1℃培養(yǎng)基培養(yǎng)24h-48h。

2）糞鏈球菌、乙型溶血性鏈球菌：復蘇水化液為腦心浸液培養(yǎng)基，復蘇培養(yǎng)基為血平板，復蘇培養(yǎng)條件37±1℃培養(yǎng)基培養(yǎng)24h-48h。

3）VB0非01群霍亂弧菌：復蘇水化液為堿性蛋白胨水，復蘇培養(yǎng)基為堿性瓊脂，復蘇培養(yǎng)條件37±1℃培養(yǎng)基培養(yǎng)24h-48h。

4）副溶血性弧菌、創(chuàng)傷弧菌：復蘇水化液為3％NaCl堿性蛋白胨水，充分懸浮后放置于37±1℃下復蘇8-12小時；再轉接培養(yǎng)基為3％NaCl營養(yǎng)瓊脂，培養(yǎng)條件37±1℃培養(yǎng)基培養(yǎng)24h-48h。

注意事項：

由于副溶血性弧菌、創(chuàng)傷弧菌對低溫比較敏感，在凍干保存過程中菌量數級下降，因此需要先增菌后轉接，否則會復蘇失敗。

5）單核細胞增生李斯特氏菌：復蘇水化液為腦心浸液培養(yǎng)基，復蘇培養(yǎng)基為血平板或胰蛋白胨大豆酵母浸膏瓊脂（TSA－YE），復蘇培養(yǎng)條件37±1℃培養(yǎng)基培養(yǎng)24h-48h。 

6）生孢梭菌、產氣莢膜梭菌：復蘇水化液為腦心浸液培養(yǎng)基，復蘇培養(yǎng)基為皰肉牛肉粒肉湯加液體石蠟1cm（隔絕空氣營造厭氧環(huán)境），復蘇培養(yǎng)條件37±1℃培養(yǎng)基培養(yǎng)24h-48h。

7）空腸彎曲菌：復蘇水化液為布氏肉湯，復蘇培養(yǎng)基為血平板，復蘇培養(yǎng)條件42±1℃微需氧條件下培養(yǎng)48－72h。

8）兩歧雙歧桿菌、嬰兒雙歧桿菌：復蘇水化液為TPY肉湯，復蘇培養(yǎng)基為BBL瓊脂，復蘇培養(yǎng)條件42±1℃厭氧環(huán)境下培養(yǎng)48－72h。

9）德氏保加利亞乳桿菌：復蘇水化液為MSR肉湯，復蘇培養(yǎng)基為脫脂奶粉溶液（10%），復蘇培養(yǎng)條件37±1℃培養(yǎng)基培養(yǎng)24h-48h。

10）黑曲霉、桔青霉、繩狀青霉、白色念珠菌、啤酒酵母：復蘇水化液為沙氏液體培養(yǎng)基，復蘇培養(yǎng)基為馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA），復蘇培養(yǎng)條件25－28℃培養(yǎng)基培養(yǎng)2-5天。

溫馨提示：

? 凍干菌株復蘇需要一個最適生長環(huán)境，復蘇培養(yǎng)基不能選用選擇性培養(yǎng)基或顯色培養(yǎng)基，這些培養(yǎng)基里面含有抑菌成分不利于菌株復蘇。

? 凍干菌種為一次性使用品，開啟之后不能反復使用或保存，暫不開啟的菌種應在4℃保藏。

3、菌株純度檢查和確認

菌落形態(tài)：單菌落在分離平板上的特征

細胞形態(tài)：鏡檢

芽胞大小、位置、性狀

生化鑒定

如有雜菌污染，需劃線分純。

二、質控菌種的保藏和使用

1、質控菌株的使用

1）定量菌液制備（比濁法）

? 將純度滿意的新鮮培養(yǎng)物懸浮滅菌生理鹽水中；

? 以滅菌生理鹽水調整、制備成0.5麥氏（McFarland)濁度的菌懸液，備用；

? 使用時稀釋至合適的稀釋度。

2）麥氏（McFarland)比濁標準管的配制

例如，需配大約100cfu/mL 的細菌菌液濃度：

?  無菌操作用接種環(huán)挑取測試細菌的純培養(yǎng)物到盛有一定量無菌生理鹽水管中，混懸。

?  以比色卡作為背景目測，直到濁度與0.5 麥氏比濁標準管的濁度相一致，如右圖所示。

? 0.5 號麥氏濁度標準管相當于1×10^8CFU/mL 濃度，以此為參照值，取1mL 濁度跟0.5 號麥氏濁度標準管相一致的菌懸液到9mL 無菌生理鹽水管中，作10 倍梯度稀釋10^7、10^6、10^5……，10^2 稀釋度含菌量大約為100cfu/mL。

注：

1）測試菌的純培養(yǎng)物可以是凍干菌株復蘇后純培養(yǎng)物。

2）本法僅供細菌液濃度的粗略計算。

2、菌種的保存

? 確定適宜的保藏方法。

? 同一菌株應選用兩種或以上方法進行保藏。

? 只能用一種方法保存的菌株應備份存放于兩個以上保藏設備中。

? 菌種入庫和出庫應記錄入檔。

? 重要菌種應異地保存?zhèn)浞荨?/p>

3、菌種保存方法

1）傳代培養(yǎng)法：復蘇后的第一代放于4℃冰箱或室溫保存，定期傳代培養(yǎng)。保藏時間依微生物種類而定。如，芽孢、霉菌、酵母菌保存6個月轉一次，普通細菌1個月轉一次，假單胞菌2周轉一次。

2）液體石蠟法：將無菌石蠟加在長菌的斜面或半固體上，高出斜面頂端1cm為準，隔絕空氣，試管直立，置于低溫或室溫保存。芽孢、霉菌、酵母菌保存2年，普通細菌1個月至1年。

3）甘油凍存法：將復活后經過性能確認的菌株新鮮培養(yǎng)物（一般是第二代菌株），用0.85%的滅菌生理鹽水（約1-2ml）洗斜面菌苔成菌懸液；將上述菌懸液吸取適量于滅菌管（凍存管）中（如，滅菌管容量為5ml，則取1.5ml菌

液），加入等體積的40%滅菌甘油，混勻，密封。保藏溫度為—20℃，一般可保存1-2年。

4）瓷珠保存管保存：菌株保藏管內含特制的小珠（20-25顆）和特殊溶液，只需將培養(yǎng)好的菌株接入溶液中，搖勻成菌懸液，細胞即吸附于小珠上，然后吸出溶液，將保藏管置-70℃可保存5年，置-20℃可保存2-3年。

瓷珠保存管保存具體操作：

第一步：對需要保存的菌株進行必要的純化，挑取生長旺盛時期的菌落，接入菌株

保藏管中，通常需要接入4-7環(huán)，對于苛養(yǎng)菌應多接一些；

第二步：擰上蓋子，充分劇烈震蕩；

第三步：用無菌吸管將溶液吸走，盡可能吸干；

第四步：馬上放入冰箱中，溫度越低越有利于保存（推薦使用-70℃超低溫冰箱）；

第五步：復蘇時，只需將小珠在平板上滾動或置肉湯中培養(yǎng)。

注：

1. 盡可能避免反復凍融，對于一些苛養(yǎng)菌和厭氧菌這樣做可能會影響保存效果；

2. 很多情況下，復蘇須對菌株純度檢查，必要時做生化鑒定，以確認無污染。

瓷珠法保存操作：

瓷珠保存后活化操作：

三、菌種管理要求

? 實驗室的裝備和管理：防護水平與操作對象危險程度相適應

? 制定菌種使用、保藏管理制度和標準化操作規(guī)程菌種申購、保管、領用、使用、傳代、存儲等，確保溯源性和穩(wěn)定性

? 建立文件記錄，做好紙質和數字化信息檔案備份菌名、編號、來源、鑒定特征、鑒定者、傳代情況、最適培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件、保藏方法和保藏位置等

? 保藏菌種容器表面貼上標簽

? 保存菌株應制備成儲備菌株和工作菌株，定期傳代，每次傳代至少對菌種進行形態(tài)學觀察

? 菌種管理專人負責：菌種保藏、復核鑒定和使用管理

四、菌種接收和登記

? 獲得途徑：購買、交換、接收贈送。

? 來源：專門的菌種保藏機構，如美國典型培養(yǎng)物保藏中心（ATCC）菌株或商業(yè)來源的ATCC演化菌株。

? 記錄菌株號、菌名、來源、數量、生產日期、接收日期等信息。