微生物實(shí)驗(yàn)室如果從事致病菌檢測(cè)、培養(yǎng)基質(zhì)控驗(yàn)收、方法驗(yàn)證等相關(guān)工作，就應(yīng)該備有質(zhì)控菌株。實(shí)驗(yàn)室需對(duì)使用的質(zhì)控菌株進(jìn)行規(guī)范性管理，以便有效地、安全地使用，保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，今天我們從凍干菌種的復(fù)蘇確認(rèn)、質(zhì)控菌種的保藏和使用、菌種管理要求、菌種接收和登記四個(gè)方面為大家詳解實(shí)驗(yàn)室質(zhì)控菌種保藏、使用及管理。

一、凍干菌株的復(fù)蘇確認(rèn)

1、圖解凍干菌株復(fù)蘇具體操作

準(zhǔn)備開(kāi)啟復(fù)蘇凍干菌種的所有實(shí)驗(yàn)用品：酒精燈、75%消毒酒精棉、移液槍、接種環(huán)、培養(yǎng)基、凍干菌種（注意：所有操作應(yīng)在符合生物安全保護(hù)及無(wú)菌條件下進(jìn)行）

開(kāi)啟凍干菌種西林瓶時(shí)，用75%酒精棉消毒西林瓶表面。

然后，在無(wú)菌條件下，按鋁蓋上的箭頭方向打開(kāi)塑蓋，撕開(kāi)鋁蓋，打開(kāi)西林瓶膠塞。

用移液槍向凍干質(zhì)控菌種西林瓶加入0.3ml左右的配套液體培養(yǎng)基，水化凍干粉，將凍干質(zhì)控菌種溶解成為均勻的懸液。

用移液槍吸取適量?jī)龈煞鬯瘧乙?，移至適合其生長(zhǎng)的斜面、平板或液體培養(yǎng)基上。

或者，用接種環(huán)蘸取適量?jī)龈煞鬯瘧乙骸?/p>

接種斜面

或平板劃線接種（便于觀察菌落形態(tài)）

接種完后，在器皿上標(biāo)記菌種編號(hào)、傳代數(shù)、日期等信息。

倒置放進(jìn)恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

最后，將轉(zhuǎn)接的斜面或平板以及西林瓶里剩余的菌懸液放置于36°C培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)

次日，觀察菌種的生長(zhǎng)情況，如未生長(zhǎng)，應(yīng)繼續(xù)培養(yǎng)24H，或吸取西林瓶里的懸液再次接種斜面或平板培養(yǎng)基，培養(yǎng)24H觀察。

2、凍干菌株復(fù)蘇補(bǔ)充說(shuō)明

1）志賀氏菌、阪崎腸桿菌、肺炎克雷伯氏菌、陰溝腸桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌、奇異變形桿菌、普通變形桿菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌、粘質(zhì)沙雷伯氏菌、弗氏檸檬酸桿菌、銅綠假單胞菌、芽孢桿菌類、大腸埃希氏菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、藤黃微球菌：復(fù)蘇水化液為腦心浸液培養(yǎng)基，復(fù)蘇培養(yǎng)基為營(yíng)養(yǎng)瓊脂，復(fù)蘇培養(yǎng)條件37±1℃培養(yǎng)基培養(yǎng)24h-48h。

2）糞鏈球菌、乙型溶血性鏈球菌：復(fù)蘇水化液為腦心浸液培養(yǎng)基，復(fù)蘇培養(yǎng)基為血平板，復(fù)蘇培養(yǎng)條件37±1℃培養(yǎng)基培養(yǎng)24h-48h。

3）VB0非01群霍亂弧菌：復(fù)蘇水化液為堿性蛋白胨水，復(fù)蘇培養(yǎng)基為堿性瓊脂，復(fù)蘇培養(yǎng)條件37±1℃培養(yǎng)基培養(yǎng)24h-48h。

4）副溶血性弧菌、創(chuàng)傷弧菌：復(fù)蘇水化液為3％NaCl堿性蛋白胨水，充分懸浮后放置于37±1℃下復(fù)蘇8-12小時(shí)；再轉(zhuǎn)接培養(yǎng)基為3％NaCl營(yíng)養(yǎng)瓊脂，培養(yǎng)條件37±1℃培養(yǎng)基培養(yǎng)24h-48h。

注意事項(xiàng)：

由于副溶血性弧菌、創(chuàng)傷弧菌對(duì)低溫比較敏感，在凍干保存過(guò)程中菌量數(shù)級(jí)下降，因此需要先增菌后轉(zhuǎn)接，否則會(huì)復(fù)蘇失敗。

5）單核細(xì)胞增生李斯特氏菌：復(fù)蘇水化液為腦心浸液培養(yǎng)基，復(fù)蘇培養(yǎng)基為血平板或胰蛋白胨大豆酵母浸膏瓊脂（TSA－YE），復(fù)蘇培養(yǎng)條件37±1℃培養(yǎng)基培養(yǎng)24h-48h。 

6）生孢梭菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌：復(fù)蘇水化液為腦心浸液培養(yǎng)基，復(fù)蘇培養(yǎng)基為皰肉牛肉粒肉湯加液體石蠟1cm（隔絕空氣營(yíng)造厭氧環(huán)境），復(fù)蘇培養(yǎng)條件37±1℃培養(yǎng)基培養(yǎng)24h-48h。

7）空腸彎曲菌：復(fù)蘇水化液為布氏肉湯，復(fù)蘇培養(yǎng)基為血平板，復(fù)蘇培養(yǎng)條件42±1℃微需氧條件下培養(yǎng)48－72h。

8）兩歧雙歧桿菌、嬰兒雙歧桿菌：復(fù)蘇水化液為TPY肉湯，復(fù)蘇培養(yǎng)基為BBL瓊脂，復(fù)蘇培養(yǎng)條件42±1℃厭氧環(huán)境下培養(yǎng)48－72h。

9）德氏保加利亞乳桿菌：復(fù)蘇水化液為MSR肉湯，復(fù)蘇培養(yǎng)基為脫脂奶粉溶液（10%），復(fù)蘇培養(yǎng)條件37±1℃培養(yǎng)基培養(yǎng)24h-48h。

10）黑曲霉、桔青霉、繩狀青霉、白色念珠菌、啤酒酵母：復(fù)蘇水化液為沙氏液體培養(yǎng)基，復(fù)蘇培養(yǎng)基為馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA），復(fù)蘇培養(yǎng)條件25－28℃培養(yǎng)基培養(yǎng)2-5天。

溫馨提示：

? 凍干菌株復(fù)蘇需要一個(gè)最適生長(zhǎng)環(huán)境，復(fù)蘇培養(yǎng)基不能選用選擇性培養(yǎng)基或顯色培養(yǎng)基，這些培養(yǎng)基里面含有抑菌成分不利于菌株復(fù)蘇。

? 凍干菌種為一次性使用品，開(kāi)啟之后不能反復(fù)使用或保存，暫不開(kāi)啟的菌種應(yīng)在4℃保藏。

3、菌株純度檢查和確認(rèn)

菌落形態(tài)：?jiǎn)尉湓诜蛛x平板上的特征

細(xì)胞形態(tài)：鏡檢

芽胞大小、位置、性狀

生化鑒定

如有雜菌污染，需劃線分純。

二、質(zhì)控菌種的保藏和使用

1、質(zhì)控菌株的使用

1）定量菌液制備（比濁法）

? 將純度滿意的新鮮培養(yǎng)物懸浮滅菌生理鹽水中；

? 以滅菌生理鹽水調(diào)整、制備成0.5麥?zhǔn)希∕cFarland)濁度的菌懸液，備用；

? 使用時(shí)稀釋至合適的稀釋度。

2）麥?zhǔn)希∕cFarland)比濁標(biāo)準(zhǔn)管的配制

例如，需配大約100cfu/mL 的細(xì)菌菌液濃度：

?  無(wú)菌操作用接種環(huán)挑取測(cè)試細(xì)菌的純培養(yǎng)物到盛有一定量無(wú)菌生理鹽水管中，混懸。

?  以比色卡作為背景目測(cè)，直到濁度與0.5 麥?zhǔn)媳葷針?biāo)準(zhǔn)管的濁度相一致，如右圖所示。

? 0.5 號(hào)麥?zhǔn)蠞岫葮?biāo)準(zhǔn)管相當(dāng)于1×10^8CFU/mL 濃度，以此為參照值，取1mL 濁度跟0.5 號(hào)麥?zhǔn)蠞岫葮?biāo)準(zhǔn)管相一致的菌懸液到9mL 無(wú)菌生理鹽水管中，作10 倍梯度稀釋10^7、10^6、10^5……，10^2 稀釋度含菌量大約為100cfu/mL。

注：

1）測(cè)試菌的純培養(yǎng)物可以是凍干菌株復(fù)蘇后純培養(yǎng)物。

2）本法僅供細(xì)菌液濃度的粗略計(jì)算。

2、菌種的保存

? 確定適宜的保藏方法。

? 同一菌株應(yīng)選用兩種或以上方法進(jìn)行保藏。

? 只能用一種方法保存的菌株應(yīng)備份存放于兩個(gè)以上保藏設(shè)備中。

? 菌種入庫(kù)和出庫(kù)應(yīng)記錄入檔。

? 重要菌種應(yīng)異地保存?zhèn)浞荨?/p>

3、菌種保存方法

1）傳代培養(yǎng)法：復(fù)蘇后的第一代放于4℃冰箱或室溫保存，定期傳代培養(yǎng)。保藏時(shí)間依微生物種類而定。如，芽孢、霉菌、酵母菌保存6個(gè)月轉(zhuǎn)一次，普通細(xì)菌1個(gè)月轉(zhuǎn)一次，假單胞菌2周轉(zhuǎn)一次。

2）液體石蠟法：將無(wú)菌石蠟加在長(zhǎng)菌的斜面或半固體上，高出斜面頂端1cm為準(zhǔn)，隔絕空氣，試管直立，置于低溫或室溫保存。芽孢、霉菌、酵母菌保存2年，普通細(xì)菌1個(gè)月至1年。

3）甘油凍存法：將復(fù)活后經(jīng)過(guò)性能確認(rèn)的菌株新鮮培養(yǎng)物（一般是第二代菌株），用0.85%的滅菌生理鹽水（約1-2ml）洗斜面菌苔成菌懸液；將上述菌懸液吸取適量于滅菌管（凍存管）中（如，滅菌管容量為5ml，則取1.5ml菌

液），加入等體積的40%滅菌甘油，混勻，密封。保藏溫度為—20℃，一般可保存1-2年。

4）瓷珠保存管保存：菌株保藏管內(nèi)含特制的小珠（20-25顆）和特殊溶液，只需將培養(yǎng)好的菌株接入溶液中，搖勻成菌懸液，細(xì)胞即吸附于小珠上，然后吸出溶液，將保藏管置-70℃可保存5年，置-20℃可保存2-3年。

瓷珠保存管保存具體操作：

第一步：對(duì)需要保存的菌株進(jìn)行必要的純化，挑取生長(zhǎng)旺盛時(shí)期的菌落，接入菌株

保藏管中，通常需要接入4-7環(huán)，對(duì)于苛養(yǎng)菌應(yīng)多接一些；

第二步：擰上蓋子，充分劇烈震蕩；

第三步：用無(wú)菌吸管將溶液吸走，盡可能吸干；

第四步：馬上放入冰箱中，溫度越低越有利于保存（推薦使用-70℃超低溫冰箱）；

第五步：復(fù)蘇時(shí)，只需將小珠在平板上滾動(dòng)或置肉湯中培養(yǎng)。

注：

1. 盡可能避免反復(fù)凍融，對(duì)于一些苛養(yǎng)菌和厭氧菌這樣做可能會(huì)影響保存效果；

2. 很多情況下，復(fù)蘇須對(duì)菌株純度檢查，必要時(shí)做生化鑒定，以確認(rèn)無(wú)污染。

瓷珠法保存操作：

瓷珠保存后活化操作：

三、菌種管理要求

? 實(shí)驗(yàn)室的裝備和管理：防護(hù)水平與操作對(duì)象危險(xiǎn)程度相適應(yīng)

? 制定菌種使用、保藏管理制度和標(biāo)準(zhǔn)化操作規(guī)程菌種申購(gòu)、保管、領(lǐng)用、使用、傳代、存儲(chǔ)等，確保溯源性和穩(wěn)定性

? 建立文件記錄，做好紙質(zhì)和數(shù)字化信息檔案?jìng)浞菥⒕幪?hào)、來(lái)源、鑒定特征、鑒定者、傳代情況、最適培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件、保藏方法和保藏位置等

? 保藏菌種容器表面貼上標(biāo)簽

? 保存菌株應(yīng)制備成儲(chǔ)備菌株和工作菌株，定期傳代，每次傳代至少對(duì)菌種進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察

? 菌種管理專人負(fù)責(zé)：菌種保藏、復(fù)核鑒定和使用管理

四、菌種接收和登記

? 獲得途徑：購(gòu)買、交換、接收贈(zèng)送。

? 來(lái)源：專門的菌種保藏機(jī)構(gòu)，如美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（ATCC）菌株或商業(yè)來(lái)源的ATCC演化菌株。

? 記錄菌株號(hào)、菌名、來(lái)源、數(shù)量、生產(chǎn)日期、接收日期等信息。