產品名稱：腸道侵襲性大腸埃希氏菌EIEC核酸檢測試劑盒(PCR-熒光探針法)
英文名稱：Multiplex PCR Detection Kit for Diarrheogenic Escherichia coli(Fluorescent Probe Assays)
產品編號與包裝規(guī)格：
| 編號 | 規(guī)格 |
| FZ022BF2 | 48 測試/盒 |
產品簡介：本試劑盒僅適用于食品中產志賀毒素（STEC）/腸道出血性（EHEC）、腸道致病性（EPEC）、腸道集聚性（EAEC）、腸道侵襲性（EIEC）、產腸毒素（ETEC）大腸埃希氏菌的毒力基因和類型判別的定性檢測。
檢測原理：基 于 Real Time PCR 技 術 ， 利 用 針 對《GB4789.6-2016》中的 12 個毒力基因設計的引物、熒光探針以及其他反應優(yōu)化配置所需試劑組合成 A、B、C 三管體系，同時往三管體系加入待檢樣品即可進行擴增反應。在發(fā)生擴增過程中，熒光探針與目的基因片段結合，可被 Taq 酶分解并產生熒光信號，此時熒光定量PCR 儀可識別該熒光信號，同時根據其強弱變化繪制出相應的實時擴增曲線，進而判定大腸埃希氏菌的致瀉類型。
A 管體系可用于 STEC/EHEC、EPEC 檢測，B 管體系可用于 EAEC 檢測和大腸埃希氏菌種屬鑒定，C 管體系可用于 ETEC、EIEC 檢測。
腸道侵襲性大腸埃希氏菌EIEC核酸檢測試劑盒(PCR-熒光探針法)產品組分：
儲存條件與保質期：-20℃避光儲存，有效期為 12 個月，避免反復凍融。冷凍條件下運輸。
靈敏度：單通道最低檢驗限達到 100~500 cfu/Test。
所需其他材料和適用儀器：熒光定量 PCR 儀（具有能夠檢測 FAM、VIC、Cy5、ROX 標記的熒光通道）、高速離心機、移液器、移液槍頭及離心管等。
腸道侵襲性大腸埃希氏菌EIEC核酸檢測試劑盒(PCR-熒光探針法)使用指南：
1，樣品前處理：參照 GB 4789.6?2016，使用 1 μL 接種環(huán)刮取營養(yǎng)瓊脂平板或斜面上培養(yǎng) 18 h~24 h 的待鑒定的可疑菌落，懸浮到含 30 μL 裂解液或者無菌水的 0.2 mL 無菌離心管中，充分懸浮菌體，輕彈管壁消除氣泡，99℃加熱 10 min；12000 r/min 離心 15 min，上清即為粗提的 DNA，可轉移至 0.2 mL 無菌離心管中，在-20℃下可長期保存。也可以選擇商業(yè)化的細菌基因組提取試劑盒進行提?。?/p>
2, 加樣、反應
1) 按照需求取 n 個 PCR 反應管（n=1 管陰性對照+待檢測樣品數+1 管陽性對照），從試劑盒中取出預混液，充分融化，渦旋后短暫離心，以上每管加入 20 μL 預混液，待用。
2) 向上述 n 個反應管中分別加入陰性對照、待測樣品 DNA、陽性對照各 5 μL，總反應體積為 25 μL。蓋緊管蓋，短暫離心，立即進行 PCR 擴增反應。
3) PCR 反應體系為 25 μL，取 FAM、VIC、Cy5、ROX 檢測通道，在反應階段 2 中 59℃時收集熒光信號，具體程序如下：
| 反應階段 | 溫度 | 時間 | 信號收集 | 循環(huán)數 |
| 1 | 95°C | 1 min | 1 | |
| 2 | 95°C | 10 sec | } 40 | |
| 59°C | 40 sec | ? |
3, 結果：一般情況下，可通過軟件自動設定的基線、閾值等直接讀取檢測結果。如需調整，可根據所使用儀器的自身情況（如噪聲等）以及選取的不同熒光通道進行調整。
1) 質量控制：陰性對照未出現明顯的 S 型擴增曲線或Ct 值＞37，陽性對照出現 S 型擴增曲線且其 Ct 值＜25。若陰陽性對照不同時滿足上述條件，則本次檢測結果無效，應重新檢測或與產品技術支持聯系。
2) 結果判讀：（根據反應所得 Ct 值判讀，具體見下表：）
| Ct值 | 每個基因判讀結果 |
| ≤30 | 對應的基因陽性。 |
| 30~37 | 建議重新檢測，若復測結果 Ct≥37，則對應的基因陰性；若重做結果 Ct＜37，擴增曲線有明顯起峰，該樣本判斷為陽性。 |
| ≥37 | 對應的基因陰性。 |
各致病型陽性判別標準：
? astA 和 pic 基因可在細菌間轉移，當與其他 DEC 毒力基因檢測結果同時陽性時，則 astA 和 pic 基因不作為型別判定依據。
? stp 基因靈敏度稍低，為保證檢測結果，檢測樣品的 DNA 濃度高一點為好。
? 一般豬源的 ST 基因和人源的 ST 基因在分離的菌株中只存在其中一種，特殊情況下除外。
? 多重 qPCR 檢測可能出現不同熒光通道之間競爭抑制的問題，單基因分析時適當調整閾值線。
