微生物的分類是為了把各種微生物按照親緣關(guān)系分門別類，方便人們對(duì)微生物進(jìn)行鑒定和交流；而微生物鑒定是為了將未知的菌株按照其生物學(xué)特性進(jìn)行分類或者說歸類，微生物分類采用的是鑒定的方法，微生物鑒定后又需要按照分類規(guī)則歸類，二者相輔相成，密不可分。

曾經(jīng)從朋友那里獲得一株枯草芽孢桿菌，經(jīng)過三個(gè)月的試驗(yàn)，活菌數(shù)一直達(dá)不到枯草芽孢桿菌的平均水平，一度懷疑是不是做的有問題或原料有問題亦或是人員操作不當(dāng)，經(jīng)過排查，菌種并非枯草芽孢桿菌，實(shí)驗(yàn)過程中為什么沒有發(fā)現(xiàn)？因?yàn)橥粋€(gè)屬相近的種之間很類似，很多時(shí)候沒法用肉眼進(jìn)行辨別，引用伯杰細(xì)菌鑒定手冊中給種的定義，凡是與典型培養(yǎng)菌非常相同的其他培養(yǎng)菌統(tǒng)一起來。烏龍事件常有，但希望不是你。所以，做好菌種分類鑒定相當(dāng)重要。

繼續(xù)鞏固一下前面的知識(shí)，
分類是根據(jù)微生物的相似性和親緣關(guān)系，將微生物歸入不同的類群（分類單元）；
命名是根據(jù)國際生物命名法規(guī)給微生物分類單元以科學(xué)的名稱；
鑒定是將確定一個(gè)新的分類微生物屬于已經(jīng)命名的分類單元的過程；
培養(yǎng)物是指一定時(shí)間一定空間內(nèi)微生物的細(xì)胞群或生長物。

微生物分類鑒定的方法

一、傳統(tǒng)鑒定法

傳統(tǒng)鑒定方法主要通過微生物細(xì)胞的形態(tài)和生理生化習(xí)性進(jìn)行鑒定。

要想鑒定，我們首先要獲得該微生物的純培養(yǎng)物，這一點(diǎn)非常重要。只有純培養(yǎng)物才能進(jìn)行鑒定，不管是傳統(tǒng)鑒定方法還是現(xiàn)代鑒定方法，無一例外。

1 形態(tài)學(xué)特征

形態(tài)學(xué)特征分為個(gè)體形態(tài)學(xué)特征和群體形態(tài)學(xué)特征。

個(gè)體形態(tài)學(xué)特征主要借助顯微鏡進(jìn)行觀察分析，比如說，細(xì)菌細(xì)胞的大小（測微尺，主要測量直徑），形狀（桿菌、球菌還是螺旋型），排列方式（單個(gè)、八字型還是連狀），有無鞭毛，有無莢膜，芽孢的位置（側(cè)面、中間還是一端），革蘭氏染色陽性還是陰性。

群體形態(tài)特征主要通過觀察微生物生長狀態(tài)，比如說，在固體培養(yǎng)基上菌落的形態(tài)（表面是否光滑、顏色、邊緣是否圓滑，中間和邊緣是否一致、正面和反面是否一致，有無突起等），在液體培養(yǎng)基中的生長情況（有無菌膜、味道）。

在平時(shí)的實(shí)驗(yàn)研究中，主要以形態(tài)特性為主進(jìn)行菌種鑒定，既方便又實(shí)用?；旧戏蛛x出純培養(yǎng)物，鑒定也結(jié)束了。進(jìn)行菌種形態(tài)描述，拍照留存，還有最重要的一環(huán)-保藏菌種，后續(xù)詳細(xì)說明。

2 生理生化特征

微生物中涉及到生理生化實(shí)驗(yàn)共有12個(gè)：糖酵解，淀粉水解試驗(yàn)，V-P試驗(yàn)，甲基紅試驗(yàn)，靛基質(zhì)試驗(yàn)，硝酸鹽還原試驗(yàn)，明膠液化試驗(yàn)，尿素酶試驗(yàn)，氧化酶試驗(yàn)，硫化氫試驗(yàn)，三糖鐵瓊脂試驗(yàn)，硫化氫-靛基質(zhì)-動(dòng)力瓊脂試驗(yàn)。

3 生態(tài)學(xué)特性

主要包括：生長溫度(最適、最低和最高溫度)，pH值，水分，滲透壓(是否耐高滲，是否有嗜鹽性等)的適應(yīng)性，需氧性(好氧、微好氧、厭氧及兼性厭氧)，宿主的種類及其與宿主的關(guān)系(共生、互生、寄生)。

4 血清學(xué)反應(yīng)(又稱抗原抗體反應(yīng))

優(yōu)點(diǎn)：特異性強(qiáng)、靈敏度高、簡便快速。
在微生物分類鑒定中，常用已知菌種、型或菌株制成抗血清(抗體)，根據(jù)它是否與待鑒定的對(duì)象發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)來鑒定未知菌種、型或菌株(抗原)。

常用血清學(xué)試驗(yàn)：凝集反應(yīng)、沉淀反應(yīng)、補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)、免疫熒光抗體技術(shù)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、免疫組織化學(xué)等方法。

5 微生物的微型、簡便、快速或自動(dòng)化鑒定技術(shù)

經(jīng)典鑒定方法指標(biāo)明確，形態(tài)學(xué)特征觀察比較簡單，生理生化試驗(yàn)就沒那么容易，畢竟需要一個(gè)一個(gè)試驗(yàn)，但要想鑒定某個(gè)菌種是哪個(gè)種，需要花費(fèi)大量的時(shí)間和精力，尤其對(duì)于生長慢的的菌種。

微生物微型、簡便、快速或自動(dòng)化鑒定技術(shù)的出現(xiàn)，正好彌補(bǔ)了上述的不足，要不說，科技在發(fā)展，效率必須跟上。

(1)、API細(xì)菌數(shù)值檢定系統(tǒng)：可以同時(shí)檢測15個(gè)以上生化指標(biāo)，快速、準(zhǔn)確、簡便和經(jīng)濟(jì)，廣泛應(yīng)用于醫(yī)療衛(wèi)生、食品加工和環(huán)境監(jiān)測等領(lǐng)域。

(2)、“Enterotube”系統(tǒng)：由于鑒定項(xiàng)目有限，只適合于一些腸道細(xì)菌的鑒定，但準(zhǔn)確度高。

(3)、“Biolog”全自動(dòng)和手動(dòng)細(xì)菌鑒定系統(tǒng)：自動(dòng)化、快速、高效和應(yīng)用范圍廣。此系統(tǒng)適用于動(dòng)、植物檢疫，臨床和獸醫(yī)的檢驗(yàn)，食品、飲水衛(wèi)生的監(jiān)控，藥物生產(chǎn)，環(huán)境保護(hù)，發(fā)酵過程控制，生物工程研究，以及土壤學(xué)、生態(tài)學(xué)和其他研究工作等。

(4)、細(xì)菌和病毒的靈敏快速鑒定法
生物芯片法：提取DNA，PDR擴(kuò)增，鑒定
免疫傳感器法；
激光散射儀法。

6 數(shù)值分類法

該方法是利用現(xiàn)代手段進(jìn)行表型特性鑒定的方法。需要的指標(biāo)較多，但結(jié)果也算穩(wěn)定和客觀。

盡管自動(dòng)化技術(shù)彌補(bǔ)了一部分經(jīng)典方法的缺點(diǎn)，還有一個(gè)缺點(diǎn)就是不夠客觀，不能很準(zhǔn)確的鑒定菌種，容易犯經(jīng)驗(yàn)主義錯(cuò)誤。隨著現(xiàn)代鑒定技術(shù)的革新，以表型特征進(jìn)行鑒定的經(jīng)典鑒定方法逐漸邊緣化，成為輔助性的鑒定方法。

二、核算鑒定法

1 DNA的堿基組成（G+C）mol%

（G+C）mol%，也叫GC比，目前發(fā)表任何微生物新種時(shí)所必須具有的重要指標(biāo)，即

（1）親緣關(guān)系相近的種，其基因組的核苷酸序列相近，兩者的GC比也接近；
（2）GC比差距很大的兩種微生物，它們的親緣關(guān)系必然較遠(yuǎn)；
（3）GC比是建立新分類單元時(shí)的可靠指標(biāo)。

據(jù)測定，GC比相差低于2%時(shí)，沒有分類學(xué)上的意義；種內(nèi)各菌株間的差別在2.5%~4.0%間；若相差在5%以上時(shí)，就可認(rèn)為屬于不同的種了；假如差距超過10%，一般就可以認(rèn)為是不同的屬了。

2 核酸的分子雜交

3 rRNA寡核苷酸編目分析

一種通過分析原核或真核細(xì)胞中最穩(wěn)定的rRNA寡核苷酸序列同源性程度，以確定不同生物間的親緣關(guān)系和進(jìn)化譜系的方法。

原核生物：16SrRNA
真核生物：18SrRNA

對(duì)于真核微生物物種鑒定，基于測序的方法，常選擇18SrDNA + ITS區(qū)域作為基因組的靶區(qū)域進(jìn)行序列數(shù)據(jù)獲取和分析，從而得到更精準(zhǔn)的物種分類信息。

特點(diǎn)：核苷酸數(shù)適中，信息量大，易于分析。

RNA作為進(jìn)化的指征的優(yōu)點(diǎn):
- rRNA具有重要且恒定的生理功能；
- 在16SrRNA分子中，既含有高度保守的序列區(qū)域，又有中度保守和高度變化的序列區(qū)域，因而它適用于進(jìn)化距離不同的各類生物親緣關(guān)系的研究；
- 16SrRNA分子量大小適中，便于序列分析；
- rRNA在細(xì)胞中含量大(約占細(xì)胞中RNA的90%)，也易于提??；
- 16SrRNA普遍存在于真核生物和原核生物中(真核生物中其同源分子是18SrRNA)。因此它可以作為測量各類生物進(jìn)化的工具。

4 微生物全基因組序列的測定

對(duì)菌落進(jìn)行全基因組測序是菌種鑒定的終極解決方案，可以直接鑒定到菌株。相較rRNA核酸序列檢測更要準(zhǔn)確。

三、成分鑒定法

1 細(xì)胞壁的化學(xué)成份：原核生物細(xì)胞壁成分的分析，對(duì)菌種鑒定有一定的作用。

2 磷酸類脂成分的分析：位于細(xì)菌、放線菌細(xì)胞膜上的磷酸類脂成分，在不同屬中有所不同，可用作鑒別屬的指標(biāo)。

3 氣相色譜技術(shù)用于微生物鑒定：氣相色譜技術(shù)主要分析微生物細(xì)胞和代謝產(chǎn)物中的脂肪酸和醇類等成分，進(jìn)而對(duì)菌種進(jìn)行分類，尤其對(duì)厭氧菌等的鑒定十分有用。

文章來源：環(huán)凱轉(zhuǎn)載于“ 微生物知識(shí)庫”公眾號(hào)；原標(biāo)題：“微生物分類鑒定的方法”；作者~發(fā)酵菌人。
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