一、藥敏試驗(yàn)定義解析

藥敏試驗(yàn)，即藥物敏感度試驗(yàn)，又叫耐藥試驗(yàn)。簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，藥敏試驗(yàn)是了解某微生物（病毒、細(xì)菌等）對(duì)某些抗生素的敏感程度或耐受程度。

這里的“藥物”，一般指抗生素類(lèi)藥物。

這里的“敏感度”，包括“敏感”、“中介”和“耐藥”。

二、藥敏試驗(yàn)?zāi)康?/strong>

為了了解病原微生物對(duì)各種抗生素的敏感（或耐受）程度，以指導(dǎo)臨床合理選用抗生素類(lèi)藥物而進(jìn)行的微生物學(xué)試驗(yàn)。

1.指導(dǎo)治療：為了解致病菌對(duì)哪種抗菌素敏感，以合理用藥，減少盲目性，往往需要進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。這對(duì)于避免藥物濫用、降低治療成本、縮短治療周期都非常重要。

2.耐藥監(jiān)測(cè)：抗菌藥物的廣泛應(yīng)用所產(chǎn)生的耐藥菌株也隨之增加，通過(guò)耐藥監(jiān)測(cè)，可以及時(shí)發(fā)現(xiàn)并應(yīng)對(duì)耐藥性問(wèn)題，這對(duì)于維護(hù)公共衛(wèi)生安全、控制疾病的傳播具有重要意義。

3.新藥驗(yàn)證：通過(guò)與現(xiàn)有藥物的對(duì)比試驗(yàn)，可以評(píng)估新藥對(duì)病原體的抑制或殺滅能力，為新藥的臨床應(yīng)用提供依據(jù)，也是驗(yàn)證新藥療效和安全性的重要手段之一。

三、藥敏試驗(yàn)方法-紙片擴(kuò)散法

紙片擴(kuò)散法，又名Kirbv-Bauer法，簡(jiǎn)稱(chēng)K-B法。

1.基本原理

將浸有抗菌藥的紙片貼在涂有致病菌的瓊脂平板上，紙片中所含的藥物吸取瓊脂中的水分溶解后會(huì)不斷地由紙片中心向四周擴(kuò)散，形成遞減的梯度濃度，在紙片周?chē)志鷿舛确秶鷥?nèi)待檢菌的生長(zhǎng)被抑制，從而產(chǎn)生透明的抑菌圈。抑菌圈直徑的大小反映待測(cè)菌對(duì)抗菌藥物的敏感程度，并與該藥對(duì)待檢菌的最低抑菌濃度（MIC）呈負(fù)相關(guān)，即抑菌圈愈大，MIC值愈小。

2.試驗(yàn)方法

(1)樣本收集：樣本收集過(guò)程中，要注意避免交叉污染，注意個(gè)人防護(hù)。

(2)菌種分離：取待測(cè)樣品，采用劃線(xiàn)法或涂布分離菌種。

(3)藥敏試驗(yàn)

①挑取培養(yǎng)好的純培養(yǎng)物，用無(wú)菌生理鹽水或MH 肉湯校正菌液濁度，使其與標(biāo)準(zhǔn)比濁管的濃度相同，在15min內(nèi)接種完，制備成0.5麥?zhǔn)蠞舛鹊木鷳乙骸?/span>

0.5麥?zhǔn)蠞舛认喈?dāng)于1.5×10^8cfu/mL菌懸液。

②用無(wú)菌棉拭子蘸取上述菌懸液，在試管壁上擠壓幾次，壓去多余的菌液，涂布整個(gè)MH固體平板表面，再重復(fù)2次，使整個(gè)平板涂布均勻，最后用棉拭子涂布平板四周邊緣。

③涂布菌液的平板于室溫中干燥3-5min ，讓平板充分吸收菌液。

④用無(wú)菌鑷子夾取藥敏紙片，貼于平板表面，并用鑷尖輕壓一下紙片，使其貼平。

紙片位置固定不能再次移動(dòng)。

每張紙片的間距不小于 24 mm，紙片的中心距平板的邊緣不小于 15 mm，90mm直徑的平板宜貼6張藥敏紙片。貼完紙片后，應(yīng)在15 min 內(nèi)將平板倒置。

⑤將貼好紙片的平板放置于35℃恒溫箱中孵育18-24h后，用卡尺量取抑菌圈直徑。

個(gè)別菌種孵育溫度、時(shí)間及條件應(yīng)按照 CLSI規(guī)定。

3.結(jié)果判斷

“敏感”是指用某種藥物的常規(guī)劑量時(shí)，治療該種細(xì)菌引起的感染有效，即使用該藥常規(guī)劑量時(shí)達(dá)到的平均血藥濃度達(dá)到 MIC的5倍或以上。

“中介”是指當(dāng)細(xì)菌引起的感染僅在應(yīng)用高劑量抗菌藥時(shí)有效，或者細(xì)菌處于體內(nèi)抗菌藥濃縮的部位或體液（如尿、膽汁、腸腔等）中時(shí)才被抑制，中介時(shí)達(dá)到的平均血濃度一般相當(dāng)于或略高于對(duì)細(xì)菌的MIC。對(duì)于毒性較小的藥物，適當(dāng)加大劑量仍可望獲得臨床療效。

“耐藥”是指藥物對(duì)某一細(xì)菌的MIC高于藥物在血或體液內(nèi)可能達(dá)到的濃度時(shí)，或細(xì)菌能產(chǎn)生滅活抗菌藥的酶或其他耐藥機(jī)制，則不論其 MIC值大小如何，仍應(yīng)判定該菌為耐藥。例如產(chǎn)青霉素酶的金黃色葡萄球菌即應(yīng)認(rèn)為該菌對(duì)青霉素耐藥。

四、紙片擴(kuò)散法在普通微生物實(shí)驗(yàn)室中應(yīng)用實(shí)例

1.菌種

大腸桿菌斜面菌種，金黃色葡萄球菌斜面菌種。

2.培養(yǎng)基和試劑

MH培養(yǎng)基，大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的菌液

3.菌液制備

采用劃線(xiàn)法將大腸桿菌菌種接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板，35℃培養(yǎng)16-18小時(shí)，然后挑取單菌落，重懸于3mL無(wú)菌生理鹽水中，混勻后與標(biāo)準(zhǔn)菌液比濁管比濁。調(diào)整濁度與比濁管（ 0.5麥?zhǔn)蠁挝唬┫嗤?/span>

4.倒平板

將MH瓊脂培養(yǎng)基溶化后倒平板，注意平皿中培養(yǎng)基厚度均勻，倒3套平板。

90mm×15mm，平板厚度均勻，約4mm厚，大約1/3高度。

5.涂平板

用無(wú)菌棉棒蘸取菌液（金黃色葡萄球菌）。將多余菌液在液面上方管壁內(nèi)輕輕旋轉(zhuǎn)擠出，涂布在MH瓊脂平板整個(gè)平面三次，每次旋轉(zhuǎn)60度，最后沿周邊繞兩圈，保證涂均勻，平板加蓋室溫干燥5min。

6.標(biāo)記

將上述平皿底用記號(hào)筆分成若干等分，分別標(biāo)明一種藥敏片的名稱(chēng)。紙片序號(hào)對(duì)應(yīng)的藥品：①氨芐青霉素；②鏈霉素；③氯霉素；④慶大霉素；⑤萬(wàn)古霉素；⑥卡那霉素。

7.貼濾紙片

用無(wú)菌鑷子取無(wú)菌濾紙片（青霉素，鏈霉素，等）分別貼在平板上相應(yīng)位置，在平板中央貼上僅有無(wú)菌生理鹽水的濾紙片作為對(duì)照。輕壓紙片使之緊貼瓊脂表面(不要在培養(yǎng)基表面拖動(dòng)濾紙片)。

8.培養(yǎng)觀(guān)察

將上述平板倒置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀(guān)察并記錄抑菌圈大小。18-24小時(shí)后測(cè)量抑菌圈直徑，從平板背面測(cè)量最接近的整數(shù)毫米數(shù)并記錄抑菌環(huán)的邊緣以肉眼見(jiàn)不到細(xì)菌明顯生長(zhǎng)為限。

有的菌株可出現(xiàn)蔓延生長(zhǎng)，進(jìn)入抑菌環(huán)，磺胺藥在抑菌環(huán)內(nèi)出現(xiàn)輕微生長(zhǎng)，這些都不作為抑菌環(huán)的邊緣。結(jié)果判斷依據(jù)鑒定所藥敏紙片判定標(biāo)準(zhǔn)。

五、注意事項(xiàng)

1.沒(méi)有特別說(shuō)明，培養(yǎng)基為M-H培養(yǎng)基，4mm厚。

原因：產(chǎn)品批間敏感試驗(yàn)重復(fù)性好；磺胺、甲氧芐嘧啶、四環(huán)素的抑制物含量低；絕大多數(shù)致病菌生長(zhǎng)好；有關(guān)敏感試驗(yàn)的數(shù)據(jù)是由此培養(yǎng)基得出的。M-H培養(yǎng)基的成分較為疏松，利于抗生素的擴(kuò)散，使其可以顯現(xiàn)明顯的生長(zhǎng)抑制帶。

2.MH培養(yǎng)基和營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的區(qū)別

MH(Mueller-Hinton)培養(yǎng)基指的是水解酪蛋白培養(yǎng)基，它是NCCLS美國(guó)國(guó)家臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)采用的需氧菌及兼性厭氧菌藥敏試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基，pH7.2-7.4。

MH的成分包括酸水解酪蛋白、牛肉浸出粉和可溶性淀粉，這些成分按一定比例混合制成，其中，酸水解酪蛋白和牛肉浸出粉提供氮源、維生素和氨基酸；可溶性淀粉具有強(qiáng)吸附力，可以吸收有毒的代謝產(chǎn)物。

3.紙片直徑為6.35mm，吸水性為自身的2.5-3倍，于-14℃保存。

紙片可以直接購(gòu)買(mǎi)藥敏紙片，如果沒(méi)有，在普通實(shí)驗(yàn)室做K-B試驗(yàn)也可以用濾紙代替，注意滅菌。

4.菌液濃度為0.5麥?zhǔn)蠁挝?，相?dāng)于1.5×108cfu/mL。

原因：待測(cè)菌液的濃度接種量應(yīng)該達(dá)到麥?zhǔn)媳葷岬臉?biāo)準(zhǔn)，菌液的濃度可使抑菌環(huán)縮小。抑菌圈的大小可反應(yīng)測(cè)試菌對(duì)測(cè)定藥物的敏感性，并對(duì)該藥物對(duì)測(cè)試菌的最低抑菌濃度呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。

5.藥敏試驗(yàn)一定做質(zhì)控。

每次藥敏試驗(yàn)必須用ATCC25922大腸桿菌做質(zhì)控。只有當(dāng)質(zhì)控菌株的抑菌圈直徑在允許范圍內(nèi)測(cè)試菌株的結(jié)果才可以報(bào)告。ATCC25922的結(jié)果必須與測(cè)試菌株同時(shí)記錄和報(bào)告在附表中。

文章來(lái)源：環(huán)凱轉(zhuǎn)載于“ 微生物知識(shí)庫(kù)”公眾號(hào)；原標(biāo)題：“微生物藥敏試驗(yàn)（一）：紙片擴(kuò)散法”；作者~發(fā)酵菌人。
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