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稀釋涂布平板法計(jì)數(shù)微生物的四大誤區(qū)

發(fā)布時(shí)間:2024-10-08    瀏覽次數(shù):1369

今天要跟大家分享的是一篇關(guān)于平板菌落計(jì)數(shù)的文獻(xiàn),雖然這篇文章更多的是針對(duì)應(yīng)試的,但是個(gè)人覺(jué)得對(duì)于我們?cè)诠ぷ骱涂蒲袑?shí)驗(yàn)中的實(shí)際操作也是挺有用的。特別是對(duì)單位換算,樣品稀釋操作不是很清楚的小伙伴應(yīng)該會(huì)有一定幫助。

稀釋涂布平板法計(jì)數(shù)微生物的計(jì)算公式為:

每克樣品中的菌株數(shù) = (C ÷ V) × M,C 代表某一稀釋度下平板上生長(zhǎng)的平均菌落數(shù),V 代表涂布平板時(shí)所用稀釋液的體積,M 代表稀釋倍數(shù)。

誤區(qū)1  對(duì)平均菌落數(shù)的理解

公式中的 C 不一定是所有實(shí)驗(yàn)所得菌落數(shù)的平均值。 為增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)說(shuō)服力和減小實(shí)驗(yàn)誤差,實(shí)驗(yàn)需設(shè)置對(duì)照實(shí)驗(yàn)和重復(fù)實(shí)驗(yàn)。若空白對(duì)照有菌,說(shuō)明實(shí)驗(yàn)可能被污染,相當(dāng)于質(zhì)控不在控,這種情況下不能將平板菌落數(shù)去平均值,而是需要分析可能污染的原因并重新進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

重復(fù)實(shí)驗(yàn)是將同一稀釋度的稀釋液至少涂布3個(gè)平板(一般設(shè)置3—5 個(gè)平板),選擇菌落數(shù)在 30—300 的平板計(jì)算平均菌落數(shù)。若重復(fù)實(shí)驗(yàn)中某個(gè)平板的菌落數(shù)與其他差別甚遠(yuǎn),如四個(gè)平板的菌落數(shù)分別為 42、200、256、234,菌落數(shù)42與其他數(shù)值差異過(guò)大,說(shuō)明該平板操作過(guò)程有誤,則該菌落數(shù)應(yīng)舍棄。 若舍棄后不足三個(gè)平板,不能用菌落數(shù)相近的兩個(gè)平板取平均值,應(yīng)找到原因并重做實(shí)驗(yàn)。 若計(jì)算每克樣品中的某種菌株數(shù),則 C應(yīng)代表某一稀釋度下平板上生長(zhǎng)的符合該菌菌落特征的菌落數(shù)的平均值,培養(yǎng)基上其他菌種形成的菌落數(shù)不能一并計(jì)算在內(nèi)。 如檢測(cè)1L待測(cè)水樣中的大腸桿菌數(shù)目只統(tǒng)計(jì)大腸桿菌菌落數(shù)的平均值。

誤區(qū)二  對(duì)稀釋倍數(shù)的判定 

平板中菌落數(shù)過(guò)少會(huì)導(dǎo)致計(jì)數(shù)誤差過(guò)大,菌落數(shù)過(guò)多又會(huì)造成計(jì)數(shù)困難,為確保有效活菌數(shù)的準(zhǔn)確測(cè)定,應(yīng)合理設(shè)定稀釋倍數(shù)。待測(cè)樣品中微生物數(shù)量越多,所需稀釋倍數(shù)越大,而微生物數(shù)量越少,所需稀釋倍數(shù)越小。

如測(cè)定土壤中細(xì)菌數(shù)量,一般選用10、10和 10 倍稀釋?zhuān)粶y(cè)定放線菌數(shù)量,一般選用10、10和 10倍稀釋?zhuān)粶y(cè)定真菌數(shù)量,一般選用 10、 10和 10倍稀釋?zhuān)粶y(cè)定自來(lái)水中大腸桿菌數(shù)量,一般不稀釋?zhuān)苯舆M(jìn)行涂布培養(yǎng)。


圖源:人教版高中生物教材

誤區(qū)三  對(duì)體積與質(zhì)量的單位換算 

微生物計(jì)算公式中的 V 代表涂布平板時(shí)所用稀釋液的體積,通常為0.1 mL,但若待測(cè)樣品中微生物數(shù)目較少,接種0.1mL經(jīng)培養(yǎng)后平板上菌落數(shù)達(dá)不到30,可增大接種量(如接種 1 mL)。

1cm3=1000μL=1mL=0.001L

體積和質(zhì)量的換算公式是:體積 = 質(zhì)量÷ 密度(V = m/ ρ),水的密度是 1 g/ cm3,則質(zhì)量為1g的水的體積是 1 cm3即1mL。

誤區(qū)四  對(duì)統(tǒng)計(jì)誤差的分析 

從稀釋涂布平板計(jì)數(shù)的原理分析,運(yùn)用該方法統(tǒng)計(jì)的菌落數(shù)往往比活菌的實(shí)際數(shù)目低,因?yàn)闃悠芬话悴灰淄耆稚⒊蓡蝹€(gè)細(xì)胞,當(dāng)兩個(gè)或多個(gè)活細(xì)胞連在一起時(shí),平板上觀察到的只是一個(gè)菌落。從稀釋涂布平板計(jì)數(shù)的過(guò)程分析,稀釋倍數(shù)是否合適、涂布是否均勻、培養(yǎng)環(huán)境是否能保證微生物正常生長(zhǎng)、計(jì)數(shù)是否存在漏計(jì)或重復(fù)計(jì)數(shù)等情況都會(huì)影響統(tǒng)計(jì)結(jié)果。 除此之外,還要考慮培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌落數(shù)目的影響,菌落數(shù)目需要每隔一段時(shí)間統(tǒng)計(jì)一次,選取菌落數(shù)目穩(wěn)定時(shí)的記錄作為結(jié)果,防止因培養(yǎng)時(shí)間不足遺漏菌落的數(shù)目。

知其然,還要知其所以然。

參考文獻(xiàn):張艷娟,陳兆亮,郭建坤.稀釋涂布平板法計(jì)數(shù)微生物的四大誤區(qū)[J].中學(xué)生理科應(yīng)試,2024,(04):52-53.

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