由食源性致病細(xì)菌引起的疾病一直是人類面臨的重大威脅。許多人因致病細(xì)菌感染而生病或死亡。常見(jiàn)的食源性致病菌包括金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、糞腸球菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、蠟樣芽孢桿菌和銅綠假單胞菌。這些病原體通常存在于復(fù)雜的樣本中。傳統(tǒng)方法使用耗時(shí)的過(guò)夜培養(yǎng)，然后進(jìn)行生物檢測(cè)。為了預(yù)防食源性致病菌引發(fā)的爆發(fā)，開發(fā)能夠快速分離和檢測(cè)復(fù)雜樣本中致病細(xì)菌的分析方法非常重要。

磁性納米顆粒（magnetic nanoparticles, MNPs）由于其磁性特性，可用于從復(fù)雜樣本中富集和分離目標(biāo)細(xì)菌，從而避免了耗時(shí)的過(guò)夜細(xì)菌培養(yǎng)。鐵氧化物MNPs通常與不同的金屬氧化物、聚合物、適配體、抗體、蛋白質(zhì)、葡萄糖、肽和抗生素等進(jìn)行修飾，以作為親和探針靶向細(xì)菌。磁性金屬離子，如Fe3?、Co2?、Ni2?和Gd3?，通過(guò)錨定在細(xì)菌表面上，使革蘭氏陽(yáng)性和革蘭氏陰性細(xì)菌具有磁性。由于細(xì)菌表面含有作為硬路易斯堿的含氧官能團(tuán)，根據(jù)硬軟酸堿理論，這些磁性金屬離子作為硬酸或邊界酸與細(xì)菌表面結(jié)合。磁性金屬離子與細(xì)菌復(fù)合物具有高密度的磁性金屬離子，可以通過(guò)簡(jiǎn)單放置外部磁體來(lái)輕松分離。

Eu3?作為一種生物傳感探針，由于其熒光特性，已被廣泛用于檢測(cè)各種目標(biāo)分析物。Eu3?還表現(xiàn)出順磁性，這使其成為磁性探針的潛在候選者。此外，Eu3?作為硬酸與含氧官能團(tuán)具有高親和力。盡管Eu3?作為磁性探針用于細(xì)菌捕獲尚未有報(bào)道，但其獨(dú)特的熒光和磁性使其成為一種檢測(cè)細(xì)菌的潛在工具。

近日，臺(tái)灣陽(yáng)明交通大學(xué)應(yīng)用化學(xué)系Yu-Chie Chen團(tuán)隊(duì)在Analytical Chemistry期刊上發(fā)表了題為：Europium Ion-Based Magnetic-Trapping and Fluorescence-Sensing Method for Detection of Pathogenic Bacteria的論文。

為了解決該問(wèn)題，該研究旨在開發(fā)一種利用Eu3?的熒光和磁性雙重功能檢測(cè)致病細(xì)菌的快速傳感方法。實(shí)驗(yàn)中使用了Eu3?乙酸鹽作為磁性探針，并通過(guò)與四環(huán)素（tetracycline, TC）結(jié)合增強(qiáng)其熒光。使用的細(xì)菌包括革蘭氏陽(yáng)性和革蘭氏陰性細(xì)菌，分別在特定培養(yǎng)基中培養(yǎng)。利用外部磁鐵實(shí)現(xiàn)磁性分離，隨后通過(guò)熒光光譜和MALDI-MS分析捕獲的細(xì)菌。

首先使用了革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌（金黃色葡萄球菌、糞腸球菌、蠟樣芽孢桿菌）和革蘭氏陰性細(xì)菌（銅綠假單胞菌、大腸桿菌J96、鮑曼不動(dòng)桿菌）作為模型樣品，研究了Eu3?是否可以用作磁捕集探針。圖1A顯示了僅含有Tris緩沖液的Eu3?溶液的照片，而圖1B顯示了金黃色葡萄球菌通過(guò)Eu3?捕集后經(jīng)過(guò)磁性分離的照片。在每個(gè)樣品瓶的右側(cè)放置了一個(gè)磁鐵。僅含有Eu3?的樣品中未觀察到沉淀或磁性復(fù)合物，但在含有Eu3?-細(xì)菌復(fù)合物的樣品中，瓶子靠近磁鐵的一側(cè)可見(jiàn)明顯的白色斑點(diǎn)（紅色圓圈標(biāo)出）。其他模型細(xì)菌與Eu3?混合后也觀察到了類似現(xiàn)象。這些結(jié)果表明，Eu3?可以用作捕集探針，用來(lái)磁性分離這些模型細(xì)菌。此外，Eu3?-細(xì)菌復(fù)合物顯示出顯著增加的磁性，使其在放置外部磁鐵后更易于聚集。

圖2 磁性Eu3?-細(xì)菌復(fù)合物的檢測(cè)。(A) 圖為僅含有pH 8的Tris緩沖液（0.39 mL）的空白樣品照片，(B) 圖為加入Eu3?（75 mM, 10 μL）處理后制備的金黃色葡萄球菌樣品（0.39 mL, 0.5 mg/mL）的照片。樣品在微波爐中加熱（功率：180 W，時(shí)間：2.25 min）后，通過(guò)外部釹磁鐵（約4000 G）進(jìn)行磁性分離。照片在常規(guī)光照條件下拍攝。紅色橢圓標(biāo)記了磁性Eu3?-細(xì)菌復(fù)合物的位置。

進(jìn)一步研究了該方法是否適用于定量分析。以金黃色葡萄球菌為模型細(xì)菌，研究了不同細(xì)菌濃度下的熒光強(qiáng)度變化。根據(jù)校準(zhǔn)曲線，金黃色葡萄球菌的檢測(cè)限為約3.5×10? CFU/mL。

圖3 定量分析。(A)-(C)使用Eu³⁺ (75 mM, 10 μL) 作為捕獲探針，然后進(jìn)行沖洗、漂白處理 (0.0625 %) 和添加 TC (30 μM, 30 μL)，獲得含有不同濃度金黃色葡萄球菌的樣品 (0.39 mL) 的熒光光譜 (λ_ex= 394 nm)。進(jìn)行了三次重復(fù)。濃度為1 mg mL^-1的金黃色葡萄球菌相當(dāng)于7.86*10⁹ CFU mL^-1。

此外，研究了可能存在于真實(shí)樣品中的干擾物質(zhì)對(duì)傳感結(jié)果的影響。干擾物質(zhì)包括鉀、鈉、鎂、鈣等離子，以及葡萄糖、蔗糖、蘋果酸和抗壞血酸等。通過(guò)實(shí)驗(yàn)分析，發(fā)現(xiàn)某些干擾物質(zhì)（如Mg2?和抗壞血酸）會(huì)影響傳感結(jié)果，降低熒光強(qiáng)度；而蘋果酸則會(huì)增強(qiáng)熒光強(qiáng)度。然而，當(dāng)所有干擾物質(zhì)同時(shí)存在時(shí)，整體干擾效應(yīng)很低，說(shuō)明正負(fù)效應(yīng)相互抵消。

圖4 干擾物質(zhì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響。柱狀圖顯示了熒光強(qiáng)度（616 nm）測(cè)試的匯總結(jié)果?；疑硎竞邢灅友挎邨U菌（Bacillus cereus，0.2 mg/mL）和干擾物質(zhì)的樣品，藍(lán)色柱表示僅含有干擾物質(zhì)的樣品。所有樣品都在Tris緩沖液（pH 8）中制備，加入了Eu3?（75 mM, 10 μL）作為捕集和傳感探針，隨后進(jìn)行漂白劑處理并加入四環(huán)素（TC, 30 μM, 30 μL）。

研究人員進(jìn)一步驗(yàn)證了該方法在模擬真實(shí)樣品中的應(yīng)用。向500倍稀釋的蘋果汁中加入五種不同濃度的蠟樣芽孢桿菌，使用本方法進(jìn)行捕獲和感應(yīng)。圖3A顯示了得到的熒光光譜，并根據(jù)熒光光譜在616 nm處的強(qiáng)度與樣品中添加的蠟樣芽孢桿菌的濃度的關(guān)系得出圖3B。因此，估計(jì)樣品中的蠟狀芽孢桿菌濃度為499 ng mL^?1，接近加標(biāo)濃度500 ng mL^?1。

圖5 使用標(biāo)準(zhǔn)加入法定量分析蘋果汁樣品中的蠟樣芽孢桿菌。（A）使用我們的捕獲和傳感方法后獲得的含有蠟樣芽孢桿菌（500 ng mL^?1）的蘋果汁樣品的代表性熒光光譜，其中添加了不同濃度的蠟樣芽孢桿菌。進(jìn)行了三次重復(fù)。（B）根據(jù)圖（A）中的結(jié)果得出的相應(yīng)圖。

綜上所述，通過(guò)消除耗時(shí)的過(guò)夜培養(yǎng)步驟，該研究首次報(bào)道了Eu3?可以作為捕集和傳感探針雙重功能的材料用于檢測(cè)細(xì)菌。通過(guò)使用外部磁鐵，Eu3?-細(xì)菌復(fù)合物能夠在樣品溶液中輕松分離，同時(shí)金黃色葡萄球菌的檢測(cè)限達(dá)到了10? CFU/mL。該方法的關(guān)鍵優(yōu)勢(shì)在于其簡(jiǎn)單性和快速性，使其成為潛在的便捷檢測(cè)工具。其快速篩選能力為快速高效識(shí)別細(xì)菌的存在打開了新的可能性，這在保護(hù)公共健康和食品安全方面至關(guān)重要，尤其是細(xì)菌污染對(duì)公共衛(wèi)生構(gòu)成顯著威脅。

此外，該方法還可以擴(kuò)展應(yīng)用于真菌和病毒的檢測(cè)。該方法已經(jīng)展現(xiàn)了在檢測(cè)黑曲霉孢子和慢病毒方面的潛在應(yīng)用，結(jié)果表明與空白樣品相比，黑曲霉孢子和慢病毒的顏色明顯不同。然而，仍需進(jìn)一步探索優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件，以評(píng)估該方法對(duì)其他實(shí)體（如真菌和病毒）的敏感性。

論文來(lái)源：https://doi.org/10.1021/acs.analchem.4c00655

來(lái)源：微生物安全與健康網(wǎng)，作者~段子璇。