超高特異性E. coli O157:H7活性菌株便攜式生物發(fā)光檢測(cè)
發(fā)布時(shí)間：2024-08-23 瀏覽次數(shù)：211
摘要：活的食源性致病菌繁殖迅速，對(duì)人體健康危害巨大，需要適當(dāng)?shù)姆椒ㄟM(jìn)行監(jiān)管。本研究開(kāi)發(fā)了一種便攜式三磷酸腺苷(ATP)生物發(fā)光傳感器，該傳感器對(duì)大腸桿菌O157:H7菌株具有高特異性，可通過(guò)定向噬菌體修飾的攪拌棒提取和生物增殖協(xié)同增強(qiáng)。簡(jiǎn)單地說(shuō)，選擇的噬菌體定向固定在聚二烯基二甲基氯化銨修飾的金攪拌棒上作為生物受體。經(jīng)過(guò)簡(jiǎn)單的攪拌棒吸收萃取和在LB培養(yǎng)基中的生物增殖，捕獲的大腸桿菌O157: H7的數(shù)量激增。最后用便攜式ATP生物發(fā)光傳感器對(duì)其進(jìn)行定量。該傳感器利用噬菌體的高特異性和簡(jiǎn)單的信號(hào)雙擴(kuò)增策略，在菌株水平上實(shí)現(xiàn)了對(duì)活菌的識(shí)別，具有較高的靈敏度。此外，便攜式信號(hào)讀出器使其適合現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。在最佳條件下，該方法的檢測(cè)范圍為102 ~ 107 CFU mL-1,30 min內(nèi)的最低檢出限為30 CFU mL-1。對(duì)實(shí)際樣品的檢測(cè)結(jié)果表明，該方法與平板計(jì)數(shù)法無(wú)差異，但檢測(cè)時(shí)間大大縮短。此外，該方法為活體大腸桿菌的即時(shí)檢測(cè)(POCT)提供了新的途徑，有望推廣到其他具有相應(yīng)噬菌體的毒力菌株的檢測(cè)中。
本研究設(shè)計(jì)了一種便攜式ATP生物發(fā)光傳感器，該傳感器與定向噬菌體修飾的攪拌棒提取和生物增殖相結(jié)合，可用于大腸桿菌O157:H7活毒株的快速現(xiàn)場(chǎng)鑒定。圖1闡述了噬菌體固定化攪拌棒的制備過(guò)程和ATP生物發(fā)光檢測(cè)。首先，用聚二烯丙基二甲氯化銨(PDDA)對(duì)攪拌棒進(jìn)行帶正電荷的改性。然后利用靜電吸引將帶負(fù)電荷的噬菌體頭部固定，使噬菌體的尾纖維面向溶液。這樣，噬菌體在攪拌棒上的定向固定化實(shí)現(xiàn)了特異性和高效捕獲目標(biāo)菌株。通過(guò)經(jīng)典的SBSE過(guò)程后，將捕獲的大腸桿菌O157:H7攪拌棒置于Luria-Bertani (LB)培養(yǎng)基中進(jìn)行生物增殖，進(jìn)一步提高細(xì)菌濃度。最后，利用便攜式ATP生物發(fā)光傳感器檢測(cè)大腸桿菌O157:H7活性濃度。通過(guò)對(duì)噬菌體的研究表明，本工作中的噬菌體對(duì)目標(biāo)大腸桿菌O157:H7表現(xiàn)出超高的菌株選擇性(圖2)，并且通過(guò)定向修飾后，能夠進(jìn)一步增強(qiáng)噬菌體對(duì)目標(biāo)菌的抓捕能力(圖3)。該方法具有噬菌體的高特異性識(shí)別、簡(jiǎn)單的雙擴(kuò)增策略和便攜式ATP生物發(fā)光傳感器等優(yōu)點(diǎn)，可在現(xiàn)場(chǎng)操作簡(jiǎn)單，定量測(cè)定靶菌的微量含量。
圖1. (A)噬菌體定向固定在攪拌棒上的制備工藝。(B)雙放大策略示意圖。(C)使用便攜式ATP生物發(fā)光傳感器對(duì)活大腸桿菌O157:H7菌株進(jìn)行定量檢測(cè)。
圖2.噬菌體對(duì)不同細(xì)菌及不同大腸桿菌菌株識(shí)別能力
圖3.定向修飾的噬菌體對(duì)細(xì)菌的抓捕能力
圖4. 現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)流程
總結(jié)：在這項(xiàng)工作中，利用便攜式生物發(fā)光傳感器開(kāi)發(fā)了一種快速、特異性和現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)大腸桿菌O157:H7菌株的方法。它在菌株水平上實(shí)現(xiàn)了對(duì)細(xì)菌的識(shí)別。以噬菌體攪拌棒為基礎(chǔ)，建立了一種高效的SBSE預(yù)處理方法，只需5 min即可富集大腸桿菌，實(shí)現(xiàn)了食品樣品中O157:H7大腸桿菌的快速特異性分離。此外，攪拌棒上捕獲的細(xì)菌經(jīng)LB增殖后利用便攜式ATP生物發(fā)光傳感器對(duì)活菌進(jìn)行定量檢測(cè)。檢測(cè)信號(hào)可放大36倍，LOD為30 CFU mL-1。結(jié)果表明，該方法可用于大腸桿菌O157:H7活株的定量檢測(cè)。
參考文獻(xiàn)：Cao C, Wang M, Zhang D, et al. Portable ATP bioluminescence sensor with high specificity for live Escherichia coli O157: H7 strain synergistically enhanced by orientated phage-modified stir bar extraction and bio-proliferation[J]. Biosensors and Bioelectronics, 2023, 220: 114852.
來(lái)源：微生物安全與健康網(wǎng)
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