想看懂方法驗(yàn)證(validation)報(bào)告，這些術(shù)語必學(xué)
發(fā)布時(shí)間：2024-08-14 瀏覽次數(shù)：1698
小六前段時(shí)間分別跟小伙伴們掰扯完了方法驗(yàn)證（validation）和方法確認(rèn)（verification），介紹了國際上主流的方法驗(yàn)證規(guī)則概況。在上一期快速檢驗(yàn)方法如何選擇的文章里也提到了“充分的方法驗(yàn)證”非常重要。最近有小伙伴們后臺(tái)留言，許多方法開發(fā)者都會(huì)給提供方法驗(yàn)證報(bào)告，但怎么判斷方法算充分驗(yàn)證呢？
所以接下來小六跟大家一起分享一些充分驗(yàn)證需要做的實(shí)驗(yàn)要求，但前提是先要學(xué)習(xí)這些驗(yàn)證報(bào)告中涉及的“參數(shù)術(shù)語”，它們都代表什么意思。
所以本期跟大家分享關(guān)于ISO16140-2，AOAC通則，GB4789.45中涉及的重點(diǎn)術(shù)語和解釋。
Validation
首先，需要了解這幾個(gè)驗(yàn)證通則中涉及的詞匯有哪些？
ISO16140-2:2016
定性驗(yàn)證主要參數(shù)：配對(duì)/非配對(duì)、靈敏度、相對(duì)檢出限、包容性、排他性等。
定量驗(yàn)證主要參數(shù)：相對(duì)正確度、準(zhǔn)確度、定量限、包容性、排他性等。
AOAC驗(yàn)證通則
定性驗(yàn)證主要參數(shù)：包容性、排他性、穩(wěn)健性、重復(fù)性和再現(xiàn)性等。
定量驗(yàn)證主要參數(shù)：包容性、排他性、重復(fù)性、偏差和穩(wěn)健性等。
GB4789.45驗(yàn)證通則
定性驗(yàn)證主要參數(shù)：靈敏度、包容性、排他性等。
定量驗(yàn)證主要參數(shù)：靈敏度、包容性、排他性、準(zhǔn)確度等。
我們?cè)趫?bào)告里還會(huì)經(jīng)?？吹剑簠⒖挤椒?參比方法、食品基質(zhì)、樣品等術(shù)語。
重點(diǎn)術(shù)語詳解
1、靈敏度(sensitivity)
待驗(yàn)證的定性方法從樣品中檢出目標(biāo)微生物的能力。
靈敏度體現(xiàn)方法對(duì)于樣品中極低污染水平(部分檢出水平)的目標(biāo)微生物的檢出能力，較高污染水平的樣品對(duì)于定性方法的驗(yàn)證并無太大意義。GB4789.45標(biāo)準(zhǔn)用檢出限來表示定性方法的靈敏度。如果驗(yàn)證時(shí)無參考方法，待驗(yàn)證方法的靈敏度用LOD表示。如果驗(yàn)證時(shí)有參考方法，待驗(yàn)證方法的靈敏度用RLOD 表示。
小六看到在ISO16140-2中的靈敏度(sensitivity)研究的意思與GB4789.45中不一樣，我們具體來看看！
ISO16140-2中的靈敏度研究的目的是確定參考方法和替代方法之間的靈敏度差異。靈敏度研究采用自然污染樣品和(或)人工污染的樣品。需對(duì)不同的類別(categories)和類型(types)的樣品進(jìn)行測(cè)試，用接受限進(jìn)行評(píng)價(jià)。接受限(最大可接受的差異)取決于該靈敏度研究屬于配對(duì)研究或非配研究和測(cè)試類別的數(shù)量。
這個(gè)疑問，小六在GB4789.45-2023《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 微生物檢驗(yàn)方法驗(yàn)證通則》實(shí)時(shí)指南中找到了答案：
國際上微生物檢驗(yàn)方法驗(yàn)證中的靈敏度通常指部分檢出水平樣品的陽性符合率。食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)微生物檢驗(yàn)方法沒有參考方法，可以計(jì)算陽性率，但是沒有參考的陽性率，無法計(jì)算陽性符合率，因此食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)微生物檢驗(yàn)方法無法采用國際上通常使用的靈敏度。
2、包容性(inclusivity)
待驗(yàn)證方法對(duì)目標(biāo)微生物的檢出能力。
包容性與排他性一起構(gòu)成特異性。包容性的驗(yàn)證不添加食品基質(zhì)，體現(xiàn)了方法單純的對(duì)目標(biāo)微生物的識(shí)別能力。
3、排他性(exclusivity)
待驗(yàn)證方法對(duì)非目標(biāo)微生物的抗干擾能力。
排他性的驗(yàn)證不添加食品基質(zhì)，體現(xiàn)了方法單純的不會(huì)將非目標(biāo)微生物錯(cuò)誤識(shí)別為目標(biāo)微生物的能力。
包容性和排他性不添加食品基質(zhì)，考核方法對(duì)目標(biāo)微生物純菌的識(shí)別能力。
4、檢出限(limit of detection,LOD)
檢出限是指獲得一定概率陽性測(cè)試結(jié)果時(shí)的目標(biāo)微生物濃度，是可以被檢測(cè)但不能準(zhǔn)確定量的最小濃度。需要注意的是，檢出限不是檢出與檢不出的界限，而是一定概率檢出時(shí)的濃度水平。
例如，LOD95是 95%檢出概率的目標(biāo)微生物濃度，在此濃度水平仍存在檢不出的概率5%。定性方法檢出限概率一般確定為 50%，即 LOD50。定量方法檢出限概率一般確定為 95%，即LOD95，或簡寫為 LOD。
5、相對(duì)檢出限(RLOD)
如果驗(yàn)證時(shí)有參考方法，待驗(yàn)證方法與參考方法兩者 50%檢出限的比值。ISO 16140-2:2016 中對(duì)于 RLOD 要求不高于 1.5。
定義中的檢出概率規(guī)定為“50%”。實(shí)際上，不管檢出概率是多少，待驗(yàn)證方法與參考方法兩者檢出限的比值不變。也就是說，RLOD是待驗(yàn)證方法與參考方法兩者檢出限(LOD)的比值，不一定非要 50%檢出限的比值。
6、LOD50
定性方法檢出概率為 50%時(shí)，樣品中目標(biāo)微生物的濃度。
LOD50用于在沒有參考方法的情況下確定定性方法的靈敏度。越低的數(shù)值表明定性方法的檢出能力越強(qiáng)。
定性方法的LOD50約為 0.7CFU。但是，由于食品基質(zhì)的影響，通常高于LOD50 0.7CFU，也就是說實(shí)際上增菌開始的時(shí)候需要更多的目標(biāo)微生物才能達(dá)到 50%的檢出概率，目標(biāo)微生物的生長受到食品基質(zhì)的抑制。某些食品基質(zhì)也可能使定性方法的LOD50低于0.7CFU，目標(biāo)微生物的生長受到這些種類的食品基質(zhì)的促進(jìn)。
LOD50是用部分檢出水平的樣品進(jìn)行試驗(yàn)推算出的，并不是樣品實(shí)際要達(dá)到的濃度水平。制備檢出概率為50%的樣品是不可能實(shí)現(xiàn)的。實(shí)際情況是，制備一組部分檢出水平（陽性檢出率為 25-75% 之間）的樣品或制備幾個(gè)污染水平不同的樣品(其中至少有一個(gè)污染水平為部分檢出水平)，根據(jù)每個(gè)污染水平結(jié)果的陽性率和樣品的初始污染濃度計(jì)算獲得 LOD50。
LOD50與基質(zhì)種類密切相關(guān)，不同基質(zhì)種類通常有不同的LOD50。
7、部分檢出水平(factional detection level)
采用定性方法測(cè)試一組平行樣品時(shí)，檢出概率在 25%~75%時(shí)樣品的污染水平。
部分檢出水平是樣品中目標(biāo)微生物的濃度水平需要滿足檢出概率在 25%~75%之間。GB4789.45中，部分檢出水平的樣品用于定性方法的靈敏度研究。
8、配對(duì)/非配對(duì)分析
兩種定性方法同時(shí)檢驗(yàn)?zāi)骋粯悠窌r(shí)，若第一步增菌方法相同，可使用該樣品的同一試樣進(jìn)行分析，該分析稱為“配對(duì)分析”；若第一步增菌方法不同，則使用該樣品的不同試樣分別進(jìn)行分析，該分析稱為“非配對(duì)分析”。在ISO16140-2中主要用于替代方法的定性方法驗(yàn)證研究。
9、準(zhǔn)確度(accuracy)
準(zhǔn)確度指測(cè)試結(jié)果與真值(或接受參考值)間的一致程度。
當(dāng)用于一組測(cè)試結(jié)果時(shí)，準(zhǔn)確度由系統(tǒng)誤差(偏倚)分量和隨機(jī)誤差(規(guī)定條件下的標(biāo)準(zhǔn)差)分量組成也就是說，準(zhǔn)確度包含正確度和精密度。
準(zhǔn)確度通常是針對(duì)定量方法來說的，但是定性方法重復(fù)測(cè)試獲得檢出率，將定性數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為了定量數(shù)據(jù)，定性方法也可以計(jì)算準(zhǔn)確度。
10、相對(duì)正確度研究（Relative trueness analysis）
相對(duì)正確度研究是對(duì)參考方法與替代方法獲得的結(jié)果之間的比較研究。
采用自然和/或人為污染的樣品，對(duì)不同的類別、類型以及項(xiàng)目進(jìn)行測(cè)試。使用Bland-Altman 方法分析，并繪制散點(diǎn)圖，樣品中超出差值的總平均值的 95%置信區(qū)間的樣品數(shù)量不得高于 1:20的比例。
11、穩(wěn)健性（robustness study）
測(cè)試方法保持不受微小但不能忽略的參數(shù)變化影響的能力所進(jìn)行的研究，表明方法正常使用的可靠性。
比如，金葡測(cè)試片穩(wěn)健性測(cè)試，采用金黃色葡萄球菌和大腸桿菌菌株，制備高濃度、中濃度和低濃度菌液。各5次重復(fù)，在34、36和38°C溫度下孵育24±2小時(shí)，以評(píng)估溫度變化。采用類似的方案來評(píng)估孵育時(shí)間的變化，各5個(gè)重復(fù)，在36±1℃下孵育20、24和28 h。
一般方法經(jīng)實(shí)驗(yàn)室間充分驗(yàn)證的方法，會(huì)略過此參數(shù)，因?yàn)閷?shí)驗(yàn)室間的驗(yàn)證本身已經(jīng)引入了很多不確定性的因素，故沒有必要再重復(fù)穩(wěn)健性測(cè)試。這就是為什么 AOAC- PTM 驗(yàn)證會(huì)進(jìn)行穩(wěn)健性測(cè)試，而 OMA方法一般不會(huì)測(cè)試該參數(shù)。
12、重復(fù)性（repeatability）
重復(fù)條件下的精密度。
在同一實(shí)驗(yàn)室，由同一操作人員使用相同的設(shè)備，在短時(shí)間間隔內(nèi)，以相同的方法對(duì)相同的測(cè)試項(xiàng)目進(jìn)行獨(dú)立的測(cè)試。
13、再現(xiàn)性（reproducibility）
再現(xiàn)性條件下的精密度。
在不同實(shí)驗(yàn)室，由不同的操作員使用不同設(shè)備，按照同樣測(cè)試方法，對(duì)同一測(cè)試對(duì)象相互獨(dú)立進(jìn)行的測(cè)試。
14、參考方法（Reference Method）
用于與待驗(yàn)證方法進(jìn)行比較的現(xiàn)有公認(rèn)分析方法。如ISO方法、GB4789系列方法、BAM方法等。
15、基質(zhì)（Matrix）
依據(jù)方法的預(yù)期用途納入確認(rèn)的食品、飲料或環(huán)境表面材料等。
一般包括食品大類、子類（類型）、樣品。
如：乳與乳制品（食品大類）、發(fā)酵乳（子類）、光明如實(shí)酸奶（樣品，具體到產(chǎn)品本身）。
16、樣品（Sample）
從重復(fù)測(cè)試部分中取出用以分析的樣品基質(zhì)。
樣品（自然污染的、未污染的或接種的）含有的分析物（如有）應(yīng)濃度均勻。
以上術(shù)語大家要好好學(xué)習(xí)哦！
下一期跟大家分享參照GB4789.45如何設(shè)計(jì)驗(yàn)證方案。
【參考文獻(xiàn)/內(nèi)容來源】
1、書籍：《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 微生物檢驗(yàn)方法驗(yàn)證通則》實(shí)時(shí)指南
2、ISO16140-2:2016 —替代（專有）方法對(duì)參考方法的驗(yàn)證協(xié)議
3、AOAC 國際方法委員會(huì)食品及環(huán)境表面微生物方法的驗(yàn)證指南（2012）
