2023年9月25日下午，食品安全標準與監(jiān)測評估司官網(wǎng)發(fā)布了經國家衛(wèi)生健康委和市場監(jiān)管總局聯(lián)合網(wǎng)批準的《食品安全國家標準食品微生物學檢驗乳酸菌檢驗》（GB4789.35-2023）等85項食品安全國家標準和3項修改單的公告。下新標準將代替GB4789.35-2016 《食品安全國家標準食品微生物學檢驗乳酸菌檢驗》 ，將于2024年03月06日起正式實施。

本文主要通過對比2023版與2016版標準，使讀者更好地了解乳酸菌檢驗修訂的變更發(fā)展，以便更好地掌握乳酸菌檢驗的發(fā)展方向。

本標準與 GB4789.35 2016相比 主要變化如下：
   1、增加了實時熒光PCR方法為選做方法；
   2、修改了乳酸菌的定義、樣品制備、培養(yǎng)時間;
   3、修改了嗜熱鏈球菌和乳桿菌計數(shù)方法的描述;
   4、修改了部分培養(yǎng)基成分、儲備液濃度和制備方法。

1 、范圍

本標準規(guī)定了含乳酸菌食品中乳酸菌(lactic acid bacteria)的檢驗方法。
本標準適用于含活性乳酸菌的食品中乳酸菌的檢驗。

? 無變化

2014年8月6日國家衛(wèi)生和計劃生育委員會公布的《可用于食品的菌種名單》中，還有乳球菌屬和片球菌屬?，F(xiàn)在不少乳品生產企業(yè)在發(fā)酵乳產品中添加了這些球菌。因此，進行發(fā)酵乳制品的乳酸菌檢驗時，無法避免這兩類球菌造成的干擾。

2 、術語和定義

2.1 乳酸菌lactic acid bacteria
一類可發(fā)酵糖主要產生大量乳酸的細菌的通稱，不能液化明膠、不產生咧喋、革蘭氏陽性、無運動、無芽孢、觸酶陰性、硝酸還原酶陰性及細胞色素氧化酶陰性反應的細菌。本標準中乳酸菌主要為乳桿菌屬(Lactobacillus)，雙歧桿菌屬(Bif idobacterium)和嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)。

? 變化

修改了乳酸菌的定義，增加其生化現(xiàn)象的描述。

3 、設備和材料

除微生物實驗室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設備外，其他設備和材料如下：
3.1 恒溫培養(yǎng)箱：36℃±1 ℃。
3.2 厭氧培養(yǎng)裝置：厭氧培養(yǎng)箱、厭氧罐、厭氧袋或能提供同等厭氧效果的裝置。
3.3 冰箱：2℃~8 ℃。（范圍擴大）
3.4 均質器及無菌均質袋，均質杯或滅菌乳缽。
3.5 渦旋混勻儀。
3.6 電子天平：感量0.001g。（精度升高）
3.7 實時定量PCR儀。
3.8 恒溫水浴鍋或金屬浴。
3.9 離心機：離心力≥>10 000×g。
3.10 無菌試管：18 mm×180 mm，15 mm×100 mm。
3.11 無菌吸管：1mL(具 0.0l mL刻度)、10 mL(具 0.1 mL刻度)。
3.12 微量移液器和滅菌吸頭：2 pL、10 u.L. 100 pL200 p.L 1 000 uL。
3.13 無菌錐形瓶：500 mL，250 mL。
3.14 無菌平皿：直徑90 mm。
3.15 PCR管。

? 變化

1. 增加設備：厭氧裝置、渦旋混勻儀、實時定量PCR儀、恒溫水浴鍋或金屬浴、離心機、微量移液器和滅菌吸頭、無菌平皿、PCR管等；
2. 電子天平精度由0.01g改為0.001g；主要是為了保證對于那些活菌菌種制品的稱量準確性；
3. 冰箱溫度范圍由2℃~5 ℃改為2℃~8 ℃。

4 、培養(yǎng)基和試劑

4.1 稀釋液：見附錄A中 A.1。（新增）
4.2 MRS瓊脂培養(yǎng)基(Man Rogosa Sharpe)：見附錄A中A.2。
4.3 莫匹羅星鋰鹽(Li Mupirocin)和半胱氨酸鹽酸鹽(Cysteine Hlydrochloride)改良MRS瓊脂培養(yǎng)基：見附錄A中A.3。
4.4 MC培養(yǎng)基( Modified Chalmers 培養(yǎng)基)：見附錄A中A.4。
4.5 0.5%蔗糖發(fā)酵管：見附錄A中A.5。
4.6 0.5%纖維二糖發(fā)酵管：見附錄A中A.5。
4.7 0.5%麥芽糖發(fā)酵管：見附錄A中A.5。
4.8 0.5%甘露醇發(fā)酵管：見附錄A中A.5。
4.9 0.5%水楊苷發(fā)酵管：見附錄A中A.5。
4.10 0.5%山梨醇發(fā)酵管：見附錄A中A.5。
4.11 0.5%乳糖發(fā)酵管：見附錄A中A.5。
4.12 七葉苷發(fā)酵管：見附錄A中A.6。
4.13 革蘭氏染色液：見附錄A中A.7。
4.14 生理鹽水：見附錄A 中A.8。
4.15 DNA提取液：見附錄A中 A.9。（新增）
4.16 10XPCR緩沖液：見附錄A中 A.10。（新增）
4.17 莫匹羅星鋰鹽(C26HIx;O,- Li):化學純。
4.18 半胱氨酸鹽酸鹽(C: I1;ClNO,S):純度99 %。
4.19 dNTPs。（新增）
4.20 Taq DNA聚合酶：5 U/ pL。（新增）
4.21 七種乳酸菌引物探針。（新增）
4.22 滅菌去離子水。（新增）

? 變化

增加培養(yǎng)基：稀釋液；這樣盡可能避免減少乳酸菌復蘇數(shù)量；
實時熒光PCR檢測用試劑：DNA提取液、10XPCR緩沖液、dNTPs、Taq DNA聚合酶、七種乳酸菌引物探針、滅菌去離子水等；

5 、檢驗程序

? 變化

1. 檢驗程序主要修改點為增加乳桿菌計數(shù)。

6 、操作步驟

6.1 樣品制備

6.1.1 樣品的全部制備過程均應遵循無菌操作程序。  

6.1.2  稀釋液在試驗前應在36℃±1 ℃條件下充分預熱15 min~30 min。

6.1.3 冷凍樣品可先使其在2℃~5℃條件下解凍，時間不超過18h，也可在溫度不超過45℃的條件解凍，時間不超過15min。

6.1.4 固體和半固體樣品：以無菌操作稱取25g樣品，置于裝有225 mL稀釋液的無菌均質杯內，于8 000×g ~10 000×g 均質1 min~2 min，制成1∶10樣品勻液；或置于225 mL稀釋液的無菌均質袋中，用拍擊式均質器拍打1 min~2 min制成1∶10 的樣品勻液。

6.1.5 液體樣品：液體樣品應先將其充分搖勻后以無菌吸管吸取樣品25 mL放入裝有225 mL稀釋液的無菌錐形瓶(瓶內預置適當數(shù)量的無菌玻璃珠)或均質袋中，充分振搖或拍擊式均質器拍打1 min~2 min，制成1∶10的樣品勻液。

6.1.6 經特殊技術(如包埋技術)處理的含乳酸菌食品樣品應在相應技術/工藝要求下進行有效前處理。

? 變化

1. 增加稀釋液預熱的操作；
2. 增加特除技術處理的乳酸菌食品樣品的前處理要求；
3. 液體樣品處理增加拍打均質器的操作。

6.2 稀釋及培養(yǎng)

6.2.1 用1 mL無菌吸管或微量移液器吸取1∶10樣品勻液1 mL，沿管壁緩慢注于裝有9 mL稀釋液的無菌試管巾(注意吸管或微量移液器吸頭尖端不要觸及稀釋液)，振搖試管或換用1支無菌吸管反復吹打使其混合均勻，制成1∶100 的樣品勻液。

6.2.2 另取1 mL無菌吸管或微量移液器吸頭，按上述操作順序，做10倍遞增樣品勻液，每遞增稀釋一次，即換用1次1mL滅菌吸管或吸頭。

6.2.3 經特殊技術(如包埋技術)處理的含乳酸菌食品應按照相應技術/工藝要求進行稀釋。（新增）

6.3 乳酸菌計數(shù)

6.3.1 乳酸菌總數(shù)：乳酸菌總數(shù)計數(shù)培養(yǎng)條件的選擇及結果說明見表1。

6.3.2 雙歧桿菌計數(shù)  
   根據(jù)對待檢樣品雙歧桿菌含量的估計，選擇2個~3個連續(xù)的適宜稀釋度，每個稀釋度吸取1mL樣品勻液于滅菌平皿內，每個稀釋度做兩個平皿。稀釋液移入平皿后，將冷卻至48 ℃~50 ℃的莫匹羅星鋰鹽和半胱氨酸鹽酸鹽改良MRS瓊脂培養(yǎng)基傾注入平皿15 mL~20 mL，轉動平皿使混合均勻。培養(yǎng)基凝固后倒置于36 ℃±1℃厭氧培養(yǎng)，根據(jù)雙歧桿菌生長特性，一般選擇培養(yǎng)48 h，若菌落無生長或生長較小可選擇培養(yǎng)至72 h，培養(yǎng)后計數(shù)平板上的所有菌落數(shù)。從樣品稀釋到平板傾注要求在15 min內完成。

6.3.3 嗜熱鏈球菌計數(shù)
   根據(jù)待檢樣品嗜熱鏈球菌活菌數(shù)的估計，選擇2個~3個連續(xù)的適宜稀釋度，每個稀釋度吸取1mL樣品勻液于滅菌平皿內，每個稀釋度做兩個平皿。稀釋液移入平皿后，將冷卻至48℃~50 ℃的MC瓊脂培養(yǎng)基及時傾注入平皿15 mL~20 mL，轉動平皿使混合均勻。培養(yǎng)基凝固后倒置于36 ℃±1℃有氧培養(yǎng)，根據(jù)嗜熱鏈球菌生長特性，一般選擇培養(yǎng)48 h，若菌落無生長或生長較小可選擇培養(yǎng)至72 h。嗜熱鏈球菌在MC瓊脂培養(yǎng)基平板上的菌落特征為：菌落中等偏小，邊緣整齊光滑的紅色菌落，直徑2 mm±1mm，菌落背面為粉紅色。從樣品稀釋到平板傾注要求在15 min內完成。

6.3.4 乳桿菌計數(shù)
   根據(jù)待檢樣品活菌總數(shù)的估計，選擇2個~3個連續(xù)的適宜稀釋度，每個稀釋度吸取1 mL樣品勻液于滅菌平皿內，每個稀釋度做兩個平皿。稀釋液移入平皿后，將冷卻至48 ℃~50 ℃的MRS瓊脂培養(yǎng)基傾注入平皿15 mL~20 mL，轉動平皿使混合均勻。培養(yǎng)基凝固后倒置于36℃±1℃厭氧培養(yǎng)，根據(jù)乳桿菌生長特性，一般選擇培養(yǎng)48 h，若菌落無生長或生長較小可選擇培養(yǎng)至72 h。從樣品稀釋到平板傾注要求在15 min內完成。

? 變化

1. 修改了文字描述；
2. 培養(yǎng)基溫度和傾注的培養(yǎng)基的量均改為了一定的范圍；
3. 培養(yǎng)時間根據(jù)培養(yǎng)生長特性可以培養(yǎng)48h至72 h。

6.4 菌落計數(shù)：見GB 4789.2菌落計數(shù)部分。

6.5 結果的表述：見GB 4789.2計算方法部分。

6.6 菌落數(shù)的報告：見 GB 4789.2菌落總數(shù)的報告部分。

7 、結果與報告

根據(jù)菌落計數(shù)結果出具報告，報告單位以CFU/g(mL)表示。

8 、乳酸菌的鑒定(可選做)

8.1 第一法 生化鑒定

8.1.1 純培養(yǎng)：挑取3個或以上單菌落，嗜熱鏈球菌接種于MC瓊脂平板，置36℃±1℃有氧培養(yǎng)48 h，乳桿菌屬接種于MRS瓊脂平板，置36℃±1℃厭氧培養(yǎng)48 h。

8.1.2 雙歧桿菌的鑒定：按GB 4789.34的規(guī)定操作。

8.1.3 涂片鏡檢：嗜熱鏈球菌菌體鏡下呈球形或球桿狀，直徑為0.5 um~2.0 um，成對或成鏈排列，無芽孢，革蘭氏染色陽性。乳桿菌屬鏡下菌體形態(tài)多樣，呈長桿狀；彎曲桿狀或短桿狀，無芽孢，革蘭氏染色陽性。

? 變化

1. 修改了文字描述，強調形態(tài)是在鏡下的；

8.1.4 乳酸菌種主要生化反應：乳酸菌種主要生化反應見表2和表3。

8.2 、第二法實時熒光PCR法鑒定 

8.2.1 純培養(yǎng) — 同8.1.1。

8.2.2 DNA模板制備
    使用接種環(huán)刮取 MC瓊脂平板或MRS瓊脂平板上的菌落2個~10個，懸浮于200uL滅菌生理鹽水中，充分混勻，10 000×g ~12 000×g 離心3 min，棄去上清。加入50uL DNA提取液渦旋混勻，置于100℃水浴或者金屬浴中10 min后迅速冷卻，10 000×g~12 000×g離心3 min。吸取上清液至新的PCR反應管內，作為DNA模板使用。提取后的DNA模板應置于4℃供當天使用，否則應于-20℃以下保存，并于1周內使用。
注：根據(jù)實驗室實際情況，也可用商品化試劑盒制備DNA模板。

8.2.3 PCR反應體系
    總反應體系體積為25 uL：10× PCR緩沖液2.5 uL、上下游引物(10 umol/L)各1 uL、探針(10 umol/L)0.5 pL，dNTPs(2.5 umol /L)3uL、Taq DNA聚合酶(5 U/uL)0.5uL，模板DNA 1uL、滅菌去離子水補足至25uL。每個反應均應設置至少2個平行。
注：反應體系中各試劑的量可根據(jù)具體情況或不同的反應總休積進行適當調整。亦可選用含有PCR級沖液、MgCl2 ,dNTP和Taq酶等成分基于Taqman探針的實時熒光PCR預混液。

8.2.4 PCR反應條件
    50 ℃ 5 min，95℃預變性3 min，94 ℃變性5s，60 ℃退火延伸40 s(同時收集FAM熒光)，進行40個循環(huán)。
注：PCR反應參數(shù)可根據(jù)基因擴增儀型號實時熒光PCR反應體系進行適當調整。

鑒定用引物和探針序列見表4。

8.2.5 對照設置
    檢測過程(包括DNA提取)中，每個反應均應設置陽性對照、陰性對照和空白對照。其中陽性對照模板為擴增片段的陽性克隆分子DNA或陽性菌株 DNA，陰性對照模板為非乳酸菌菌株 DNA，空白對照模板為無菌水。

8.2.6 結果判讀
8.2.6.1 對照的結果判讀
    陽性對照出現(xiàn)典型擴增曲線，Ct≤30陰性對照無典型擴增曲線或Ct≥40；空白對照無典型擴增曲線或Ct≥40。否則，結果視為無效。

8.2.6.2 樣品的結果判讀
    當樣品檢測Ct≥40時，判定樣品結果為某種乳酸菌陰性；當檢測Ct≤35，可判定該樣品結果為某種乳酸菌陽性；當檢測35<ct<40時，重復試驗，若重復試驗結果檢測ct≥40，則判定為某種乳酸菌陰性，否則，判定為某種乳酸菌陽性。ct<40時，重復試驗，若重復試驗結果檢測ct≥40，則判定為某種乳酸菌陰性，否則，判定為某種乳酸菌陽性。

來源：環(huán)凱轉載于“食品微生物檢測”公眾號，作者~食品小檢；
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