傳代培養(yǎng)幾乎是所有細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)。當(dāng)細(xì)胞在培養(yǎng)瓶中長到一定密度都會因?yàn)榻佑|抑制而停止生長，之后就需要將其稀釋分種成多瓶，細(xì)胞才能繼續(xù)生長。這一過程就叫傳代。傳代培養(yǎng)可獲得大量細(xì)胞供實(shí)驗(yàn)所需，但培養(yǎng)皿中的細(xì)胞很容易受到外界污染，培養(yǎng)液是營養(yǎng)富集的液體，可以支持細(xì)胞在其中生長，然而，水能載舟亦能覆舟，“好喝”的營養(yǎng)液，使得細(xì)菌們也能在培養(yǎng)液中快樂生長，同時(shí)離體培養(yǎng)的細(xì)胞也是各類病毒、支原體等的大愛，因此，需要周全保護(hù)細(xì)胞“寶寶”們，以下所有操作要在嚴(yán)格的無菌條件下進(jìn)行，每一步都需要認(rèn)真仔細(xì)的無菌操作。

細(xì)胞生長一般經(jīng)歷4個(gè)時(shí)期：潛伏期、對數(shù)生長期、平臺期和衰亡期【1】。其中對數(shù)生長期指細(xì)胞呈指數(shù)（2n）增長。處于對數(shù)生長期的細(xì)胞生長最快，細(xì)胞活力最強(qiáng)，是進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的最佳時(shí)間。

細(xì)胞接觸抑制是正常細(xì)胞生長增殖的關(guān)鍵特性，被認(rèn)為是調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖的關(guān)鍵機(jī)制，這種機(jī)制可以有效地防止細(xì)胞增殖失控。在培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，正常細(xì)胞在高密度情況下發(fā)生接觸抑制現(xiàn)象，使細(xì)胞周期停滯在G0/G1期，從而形成單層細(xì)胞【2】。因此我們在細(xì)胞發(fā)生接觸抑制前需要將細(xì)胞傳代來擴(kuò)大細(xì)胞數(shù)量。

材料和器材

材料：培養(yǎng)瓶/皿，離心管，移液管，移液器，廢液缸，75%酒精，所需培養(yǎng)細(xì)胞。
藥品：DMEM培養(yǎng)基，小牛血清或胎牛血清，0.25%胰蛋白酶，PBS緩沖液，青鏈霉素雙抗。
儀器：CO?培養(yǎng)箱，倒置顯微鏡，超凈臺。

實(shí)驗(yàn)步驟

細(xì)胞傳代圖解：

【預(yù)熱含10%血清的DMEM培養(yǎng)基、PBS、0.25%胰酶】

Tips：作為熱源的金屬珠浴，要留意定期消毒哦~

【從培養(yǎng)箱拿出細(xì)胞，鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)，并判斷是否達(dá)到了可傳代的密度】

【回到超凈臺中，吸去培養(yǎng)基，加入PBS，晃一晃，潤洗一遍】

可重復(fù)以上動作，用PBS再次清洗，防止殘留培養(yǎng)液中的血清影響胰酶效果。

【吸去PBS，加入0.25%胰酶】

【放入37℃培養(yǎng)箱，開始消化并計(jì)時(shí)】

【1-2min后，用含10%血清的DMEM培養(yǎng)基終止，通過吹打使細(xì)胞脫離培養(yǎng)皿底部，最后將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管】

【500 rpm細(xì)胞離心3min】

【棄上清，加DMEM培養(yǎng)基重懸】

【將細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)皿中】

具體操作及tips：

無菌操作規(guī)范：在實(shí)驗(yàn)開始前，需要將超凈臺紫外照射滅菌（至少20min），我們需要穿好滅菌服，戴好滅菌手套和口罩。

準(zhǔn)備工作：將PBS，胰酶，含10%血清的DMEM培養(yǎng)基置于37℃下預(yù)熱。滅菌離心管，槍頭提前放入超凈臺照射紫外。

所有物品從外面移入超凈臺都需要噴灑75%酒精消毒，并且同樣用75%酒精消毒雙手。

① 從培養(yǎng)箱取出細(xì)胞培養(yǎng)皿（一般選擇處于對數(shù)期的細(xì)胞），倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞密度，確定細(xì)胞是否需要傳代及細(xì)胞需要稀釋的倍數(shù)。

② 用酒精噴壺在培養(yǎng)皿表面噴灑75%酒精消毒，轉(zhuǎn)移培養(yǎng)皿到超凈臺，打開蓋子（注意酒精不要噴太多，打開蓋子也要小心，不要讓酒精誤進(jìn)入皿內(nèi)），輕輕吸出舊的培養(yǎng)液，加入適量PBS潤洗細(xì)胞1-2次（注意從側(cè)壁加入，以免沖掉細(xì)胞），棄去PBS緩沖液。

Tips：這一步的目的是要去除培養(yǎng)基中血清對胰酶消化細(xì)胞的影響喲~

③ 用移液器加入0.25%胰酶（Trypsin）于培養(yǎng)皿中（能夠鋪滿皿底即可，具體量根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要確定，過多或過少都不利實(shí)驗(yàn)），置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘。

④ 將加入胰酶的細(xì)胞培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)移到倒置顯微鏡載物臺，鏡下觀察細(xì)胞消化情況。對于貼壁牢的細(xì)胞，可用手指尖輕輕拍打培養(yǎng)皿底部，促使其脫落。待細(xì)胞大部分變圓并脫落，準(zhǔn)備終止消化，加1-2倍體積的含10%血清培養(yǎng)基終止消化。

胰酶消化與血清終止原理小課堂：

細(xì)胞外含有多種胞外蛋白，如膠原蛋白以及糖蛋白，使細(xì)胞間或細(xì)胞與培養(yǎng)瓶內(nèi)壁粘連起來，而胰蛋白酶能夠催化蛋白質(zhì)的特定肽鍵（賴氨酸或精氨酸的羧基所構(gòu)成的肽鍵）水解從而使得細(xì)胞從培養(yǎng)皿上脫落下來。而EDTA主要是通過螯合鈣鎂離子，鈣鎂離子是保持細(xì)胞間相互連接所必需的，所以沒有鈣鎂離子，貼壁細(xì)胞之間的連接就被打開了。

所以終止時(shí)我們所加的培養(yǎng)基中含有鈣鎂離子和胎牛血清，都是胰酶抑制劑，血清終止的原理其實(shí)是競爭抑制，就是用過量的血清含有的蛋白來和胰酶結(jié)合，從而不給胰酶消化細(xì)胞外蛋白的機(jī)會。

Tips：這一步要把握好時(shí)間，切勿消化過度，及時(shí)終止消化。如果消化不夠充分可以輕拍培養(yǎng)皿幫助細(xì)胞脫落，轉(zhuǎn)移進(jìn)超凈臺也別忘了酒精消毒喲~

⑤ 用1ml移液槍輕輕吹打混勻，使細(xì)胞脫離培養(yǎng)皿底部，將混合細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中（離心管規(guī)格根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要確定），配平，500-800rpm離心3-5分鐘左右。

⑥ 離心好后，輕輕取出離心管。

Tips：此時(shí)可以看到細(xì)胞在管底形成肉眼可見的細(xì)胞團(tuán)塊，團(tuán)塊大小與細(xì)胞多少有關(guān)，拿取過程中小心不要發(fā)生碰撞，把管底的細(xì)胞團(tuán)塊撞散，影響得率。

用酒精噴壺噴灑離心管表面，轉(zhuǎn)移進(jìn)超凈臺，打開蓋子，將上清液小心倒入廢液缸，加入10%血清培養(yǎng)基，用移液器輕輕吹打，制成細(xì)胞懸液。這就是待接種的種子啦~

Tips：棄上清的動作需一次完成，切忌抬起管口，讓液體流回底部后，又再次傾倒。回流的液體會把細(xì)胞團(tuán)塊沖散甚至沖起來，再傾倒有把細(xì)胞團(tuán)塊倒掉的風(fēng)險(xiǎn)。

⑦ 根據(jù)細(xì)胞生長特性，將細(xì)胞懸液按1：2-1：5的比例分到新的培養(yǎng)皿中，八字手勢晃勻后，置于倒置顯微鏡載物臺，觀察細(xì)胞情況。細(xì)胞喜歡扎堆，傳代接種應(yīng)保證一定數(shù)量，數(shù)量太少“胞二代”們會長不起來喲。

Tips：原代脂肪細(xì)胞可以少批次的傳代，因其較永生化細(xì)胞更脆弱，傳代密度適當(dāng)提高，更有利于其生長哦。

⑧ 在培養(yǎng)皿上做標(biāo)記，注明傳代時(shí)間，細(xì)胞種類，操作人員等信息。在放入培養(yǎng)箱之前應(yīng)再次用酒精噴一噴培養(yǎng)皿表面，放入培養(yǎng)箱后，把培養(yǎng)皿內(nèi)的細(xì)胞再次晃動使其鋪板均勻，防止生長密度不一，最后關(guān)上培養(yǎng)箱的門。

⑨ 傳代完成啦，記得整理操作臺，用75%酒精擦拭超凈臺臺面，清理廢液和垃圾，最后打開超凈臺內(nèi)的紫外燈。

⑩ 在細(xì)胞傳代前如果培養(yǎng)基有變黃跡象，吸去培養(yǎng)基，加入新鮮的含10%血清的DMEM培養(yǎng)基。

Tips：培養(yǎng)基的紅色是酚紅試劑的顏色，酚紅試劑是一種pH指示劑，中性時(shí)為紅色，堿性時(shí)為紫色，酸性時(shí)為黃色。細(xì)胞生長繁殖會消耗培養(yǎng)基的營養(yǎng)物質(zhì)，分泌代謝產(chǎn)物，如果細(xì)胞生長旺盛，代謝活躍，產(chǎn)生大量乳酸和CO?。在細(xì)胞培養(yǎng)48h后，培養(yǎng)液由紅變黃說明營養(yǎng)物質(zhì)消耗掉了，該換培養(yǎng)基了，此時(shí)也可以查看一下細(xì)胞密度，是否就需要傳代啦~另外如果有支原體污染，也會使培養(yǎng)基發(fā)黃，但細(xì)胞會在幾周后死亡。因此大家需要每天check好細(xì)胞狀態(tài)喲~

參考文獻(xiàn)：
【1】Eagle H et al. Nature. 1967.
【2】Abercrombie M et al. Nature. 1979