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微生物檢測中菌懸液不會制備,化驗結(jié)果怎么能保證準(zhǔn)確?

發(fā)布時間:2021-12-20    瀏覽次數(shù):2990

對于微生物實驗室的小伙伴們來說,每天除了面對接樣,檢測樣品,配培養(yǎng)基等各種瓶瓶罐罐交響曲以外,制備合適濃度的菌懸液應(yīng)該是每天的頭號大事了,畢竟有太多的項目需要合適濃度的菌懸液,產(chǎn)品方法適用性,培養(yǎng)基促生長測試,最要命的是每天產(chǎn)品檢測中的陽性對照菌菌懸液的制備……

一、操作流程


這里以大家最常用的大腸埃希菌為例,其它菌種方法類似。

1,菌種制備:從菌種保藏管中吸取少量菌液,轉(zhuǎn)接到新鮮的TSB中,于30℃-35℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18-24小時。

2,稀釋:取步驟1的培養(yǎng)物1mL,加入到9mL的pH7.0氯化鈉蛋白質(zhì)緩沖液中,進行倍比稀釋。

3,平板計數(shù):取稀釋好的菌液,一般取3個稀釋級,每個梯度取2mL,分別加入兩塊90cm的平皿中,每皿加入1mL菌液,傾注45℃左右的已經(jīng)經(jīng)過確定的TSA培養(yǎng)基,輕輕搖勻,靜置,培養(yǎng)基凝固后,置30-35℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)48小時。

4,菌落計數(shù):將培養(yǎng)后的平板,置于菌落計數(shù)器下進行菌落計數(shù),以確定哪個稀釋級的濃度能夠滿足測試的要求。

二、對應(yīng)注意事項


1,菌種制備:也可以使用TSA平板進行培養(yǎng),如果轉(zhuǎn)接的是冷凍保藏管中的菌,最好再轉(zhuǎn)接一次,使用第二次轉(zhuǎn)接的菌種。

2,稀釋:取菌液的時候,需要先對菌液進行振蕩或吹打混勻,方可吸取菌液。可以不用進行倍比稀釋,只要能保證最后加入到測試樣品中的菌的數(shù)量符合要求即可。

3,平板計數(shù):取菌液時同樣需要先將試管中的菌液進行混勻。

4,培養(yǎng)基菌落計數(shù):不建議逐日觀察結(jié)果,因為平板中可能有凝集水, 逐日觀察拿動平板,可能會導(dǎo)致水落到菌落上,菌跟著水流到下一個空白地方,導(dǎo)致結(jié)果不準(zhǔn)確;另外如果是霉菌,因為有孢子,拿動也會導(dǎo)致孢子落到平板空白地方,影響結(jié)果。

三、事后思考


1、菌液的作用

菌懸液使用有時效性要求:

2020版《中國藥典》和《歐洲藥典》8.0版要求如果放置在室溫,菌懸液必須在2小時內(nèi)使用,如果放置在2-8℃保存,可以在24小時內(nèi)使用。

那么問題來了,菌懸液的菌的數(shù)量需要在48小時后才能確定,但是在24小時之內(nèi)菌懸液必須使用,所以在不知道菌含量的情況下,樣品測試需要做至少三個梯度。

筆者之前在微生物實驗室做了5次的菌懸液制備,為了保證實驗的成功,每次都是要做三個梯度,雖然大多數(shù)都是同一個稀釋級的含量符合要求,但是還是偶爾有另一個稀釋級才符合要求的時候,所以筆者每次都乖乖的做三個梯度的測試,還好筆者那個時候依據(jù)的法規(guī)中,日常的無菌檢查和控制菌檢查中沒有陽性對照的要求。

這里說的三個梯度不是說只是計數(shù),而是菌懸液實際運用的測試中也需要三個梯度,舉個例子,某個無菌產(chǎn)品無菌檢查中的陽性對照測試,需要做三個對照。當(dāng)然,同樣的產(chǎn)品方法適用性,培養(yǎng)基促生長測試也是如此。流程圖如下:

2、步驟的繁瑣

這個流程圖中,還是省略了一些步驟,一句話帶過的倍比稀釋,做過的小伙伴們知道,這個說起來容易做起來難。

另外在接收菌種和從冷凍保藏管中取出菌種來使用時,還需要進行相應(yīng)的鑒定,所以不要覺得這個流程好冗長,其實已經(jīng)是簡單版的。

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