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微生物檢測常見細(xì)菌染色方法

發(fā)布時間:2019-11-28    瀏覽次數(shù):13141

細(xì)菌涂片及細(xì)菌染色是微生物學(xué)的基本技術(shù),也是觀察細(xì)菌最簡單且行之有效的方法,是微生物檢測人員常用技能之一。通常情況下,由于細(xì)菌個體較小,較透明或半透明,如未經(jīng)染色往往不以觀察識別。因此借助于染色法可以使細(xì)菌著色,與視野背景形成鮮明對比,從而易于在顯微鏡下進(jìn)行觀察。

微生物檢測常見的細(xì)菌染色方法包括簡單染色、負(fù)染色、革蘭氏染色、芽孢染色法、鞭毛染色、莢膜染色、死活染色。制備細(xì)菌染色片一般要經(jīng)過涂片、固定、染色、水洗、干燥等步驟,然后用顯微鏡甚至油鏡觀察。

1. 簡單染色:

在實(shí)驗(yàn)室微生物檢測過程中,不同細(xì)菌或者由于觀察者所側(cè)重觀察的內(nèi)容不同,所以使用的染料也有差異,但是簡單細(xì)菌染色的方法是一樣的。

先按照上述的制片方法制片,制成需要觀察的玻片后,使用相對應(yīng)的染料滴加到玻片上的菌膜區(qū)域,以覆蓋菌膜為準(zhǔn)。按照不同染料的要求,結(jié)合所觀察的內(nèi)容確定染色時間,染色時間到達(dá)時,進(jìn)行水洗,干燥等步驟。最后得到的玻片加蓋蓋玻片即可進(jìn)行鏡檢。如有需要可以后續(xù)再進(jìn)行油封、蠟封等封片過程。簡單細(xì)菌染色過程如下圖:

2. 負(fù)染色

制備觀察圖片是非常容易的,但是對微生物檢測初學(xué)者來說想要在玻片中找到目標(biāo)菌還是有一定難度的,因?yàn)榧?xì)菌常常無色透明且比較小,所以對初學(xué)者來說除非對光圈等進(jìn)行很精細(xì)的調(diào)節(jié),否則很難觀察到目標(biāo)菌,因此進(jìn)行負(fù)染色就十分重要。該方法是將微生物與苯胺黑或者india墨水混合,再將混合物覆蓋于載玻片表面,由于這兩種天然黑色染料不能滲入微生物細(xì)胞,所以使得透明的微生物個體在黑色的背景下很容易觀察。負(fù)染色法常見有兩種操作方法。

第一種發(fā)個方法比較常見,在一個載玻片上將微生物與異地苯胺黑混合,用另外的載玻片將混合物均勻的覆蓋于原來的載玻片上。該方法的目的是使混合物在在玻片上一邊厚一邊薄,在厚與薄中間的額區(qū)域就是最佳觀察區(qū)域。如圖所示:

第二種方法是用一接種環(huán)苯胺黑與微生物混合,用接種針在載玻片的中央將混合物延伸很小的區(qū)域。具體操作如圖所示:

3. 革蘭氏染色

革蘭氏染色是微生物檢測細(xì)菌學(xué)中廣泛使用的一種鑒別染色法。細(xì)菌先經(jīng)堿性染料結(jié)晶紫染色,而后經(jīng)碘液進(jìn)行媒染,之后用酒精脫色,在一定條件下有的細(xì)菌媒染后的顏色不會脫去,有的可以被脫去,前者叫做革蘭氏陽性菌,后者為革蘭氏陰性菌。為方便進(jìn)一步觀察,脫色后再用堿性蕃紅進(jìn)行復(fù)染,陽性菌仍為紫色,陰性菌染成紅色,這就是革蘭氏染色的原理。其步驟包括初染、媒染、脫色、復(fù)染四個步驟,主要步驟如圖所示:

4. 芽孢染色法

部分細(xì)菌能產(chǎn)生內(nèi)孢子,這些孢子能抵制細(xì)菌染色液的進(jìn)入,在微生物檢測革蘭氏染色法涂片染色時,革蘭氏陽性菌的芽孢呈現(xiàn)無色。雖然芽孢在革蘭氏染色片中可以看到,但在不易清晰觀察時,可用特殊的芽孢染色法,使芽孢與菌體呈現(xiàn)不同顏色,便于觀察。主要的芽孢染色法有孔雀綠染色法和石碳酸復(fù)紅染色法。

孔雀綠染色法的具體步驟:首先將生有芽孢的斜面菌苔按革蘭氏染色法涂片后,用飽和孔雀綠水溶液染色10min,然后用自來水沖洗,沖洗完后用0.5%蕃紅液復(fù)染30s,用水洗,吸干,即可鏡檢,鏡檢時芽孢呈綠色,菌體和芽孢囊呈微紅色。

石碳酸蕃紅染色法具體步驟:首先按常規(guī)涂片,然后滴加石碳酸復(fù)紅于涂片上,并于玻片下緩緩加熱,使染液冒蒸汽但不沸騰,并繼續(xù)滴加染液,不使涂片上染液蒸干,這樣保持5min。帶涂片冷卻后,傾去染液,用酸性乙醇脫色指無紅色染劑洗脫為止,接著徹底水洗,洗后用呂氏美藍(lán)復(fù)染2-3min,水洗吸干后即可進(jìn)行鏡檢,鏡檢時菌體計孢囊呈藍(lán)色,芽孢呈紅色。

5. 鞭毛染色法

鞭毛是細(xì)菌的運(yùn)動器官,非常纖細(xì),超出了光學(xué)顯微鏡觀察極限,因此通常情況下在顯微鏡下觀察不到。通過特殊的染色技術(shù),可以將染色液附加到鞭毛的周圍,增加它的直徑,從而能在光學(xué)顯微鏡下觀察到鞭毛。鞭毛染色一般分銀鹽法和復(fù)紅沉淀法兩種。

這里介紹一下銀鹽沉淀法。用作鞭毛染色的載玻片必須是絕對干凈無油脂的,將載玻片在火焰上快速灼燒5s,放在染色架上冷卻,用蠟筆分成兩個區(qū)域,然后用移液管或者巴斯德移液管吸取2mL無菌水加入到幼齡生長活躍的斜面菌株中,慢慢震蕩并旋轉(zhuǎn)試管使菌株懸浮,盡量避免使用接種環(huán),將懸液轉(zhuǎn)移到干凈的試管中,通過懸滴試驗(yàn)檢查菌體的運(yùn)動型,用無菌水將懸浮液稀釋至略有渾濁為止,放入20-30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30min,然后移取一滿環(huán)懸浮液加在已冷卻的載玻片一端,傾斜載玻片讓液滴流到蠟筆畫的中心線,在空氣中自然干燥。然后用媒染色劑媒染5min之后,慢慢用蒸餾水充分漂洗掉所有的媒染液,用熱的Fontana銀鹽覆蓋,染色5min,每隔1min更換一次染色液(Fontana銀液在沸水浴中加熱),細(xì)菌涂層的每一部分都要浸在染色液中,不能裸露。最有用水沖洗,自然晾干即可進(jìn)行鏡檢。應(yīng)當(dāng)注意一點(diǎn),染色法的燃料須當(dāng)日配制,4h內(nèi)使用,最好是現(xiàn)配現(xiàn)用。

6. 莢膜染色

一般細(xì)菌的莢膜與染色劑的親和性低,但莢膜通透性高,因此染料可以透過莢膜使菌體著色。一般采用負(fù)染色方法使背景和菌體之間形成一透明區(qū),將菌體襯托出來便于觀察分辨。

莢膜染色的步驟:加一滴6%葡萄糖水溶液在載玻片的一端,無菌操作,挑取細(xì)菌斜面上培養(yǎng)72h左右的膠質(zhì)芽孢桿菌與其混合,加1滴墨汁充分混勻,用推片法制片將菌液鋪成薄層,自然干燥,滴加1-2滴無水乙醇覆蓋涂片,固定1min,自然干燥,在已晾干的涂面上,滴加1%結(jié)晶紫染色液染色,2min后用20%的硫酸銅沖洗數(shù)次,再用自來水沖洗一次,使用擦鏡紙擦干后即可鏡檢。有莢膜的菌菌體呈紫色,背景灰黑色,莢膜不著色呈無色透明圈。具體操作過程見下圖:

7. 死活染色

細(xì)菌死活染色排除法是生物研究中判斷細(xì)胞活性的一種常用方法,是利用死活細(xì)胞在生理機(jī)能和性質(zhì)上的差異來進(jìn)行的,常用的染色劑有臺盼藍(lán)和美藍(lán),前者使用范圍較廣,后者一般在酵母菌細(xì)胞死活鑒定上使用較多。

以上介紹的細(xì)菌染色法,基本上涵蓋傳統(tǒng)微生物實(shí)驗(yàn)室能用到的所有的細(xì)菌染色法。染色法在細(xì)菌的觀察、分類、鑒定中經(jīng)常用到,因此是微生物檢測人員不可或缺的基本技能之一。


轉(zhuǎn)載自《食品微生物檢測工作指南》作者賈俊濤等,轉(zhuǎn)載僅為分享知識。

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