GB 4789.4沙門氏菌檢測注意事項
發(fā)布時間：2019-11-07 瀏覽次數(shù)：6446
一．沙門氏菌檢測的原因和意義
據(jù)統(tǒng)計我國細菌性食物中毒中70%～80%是由沙門氏菌引起的，人一旦攝入含有大量沙門氏菌(10E5～10E6個/g)的動物性產(chǎn)品，就會引起細菌性感染，進而在毒素作用下發(fā)生食物中毒導致胃腸炎、傷寒和副傷寒且沙門氏菌的傳播媒介眾多，肉、蛋以及食品從加工到出售的過程中都十分容易發(fā)生污染。因此對沙門氏菌檢測事關重大。
二．沙門氏菌檢測的環(huán)境
沙門氏菌檢測要在二級生物安全實驗室及二級生物安全柜(在負壓情況下防止致病微生物氣溶膠飄離實驗室對實驗人員及環(huán)境造成污染)中進行。
三．沙門氏菌檢測過程中的相關培養(yǎng)基試劑解讀
1.前增菌(無選擇性)：
緩沖蛋白胨水(BPW)是基礎增菌培養(yǎng)基，不含任何抑制成分，有利于受損傷的沙門氏菌復蘇。使受損傷的沙門氏菌細胞恢復到穩(wěn)定的生理狀態(tài)。
2.選擇性增菌：
四硫磺酸鈉煌綠增菌液(TTB)中的硫代硫酸鈉和四硫磺酸鈉結合可抑制腸道共生菌，而具有四硫磺酸鈉還原酶的細菌能在此培養(yǎng)基中繁殖；膽鹽和煌綠可抑制大腸群菌和其它革蘭氏陽性細菌生長，而傷寒與副傷寒沙門氏菌仍能生長。亞硒酸鹽胱氨酸增菌液(SC)可對傷寒及其他沙門氏菌作選擇性增菌，其成分中的亞硒酸與蛋白胨中的含硫氨基酸結合，形成亞硒酸和硫的復合物，影響細菌硫代謝，從而抑制大腸埃希氏菌、腸球菌和變形桿菌的增殖。
3.分離培養(yǎng)基(選擇性)：
①亞硫酸鉍瓊脂(BS)中的亞硫酸鉍指示劑抑制革蘭氏陽性菌和大腸菌群，但不影響沙門氏菌的生長；傷寒桿菌及其他沙門氏菌能利用葡萄糖將亞硫酸鉍還原成硫酸鉍，形成黑色菌落周圍繞有黑色和棕色的環(huán)，對光觀察可見有金屬光澤。
注意
BS不能高壓，不能過分加熱，以免降低其選擇性，應在臨用時配制，保存在陰暗處，48h后失去選擇性，保存不當導致顏色變淺說明已經(jīng)開始減效，與TTB(TTB的添加劑必須在棕色瓶儲存，不能見光，否則選擇性減弱。TTB有用于消除和吸收有毒代謝產(chǎn)物的碳酸鈣容易產(chǎn)生沉淀，分裝時一定要搖勻。TTB加入添加劑后就不能再加熱。)或SC(SC中含有劇毒物質(zhì)亞硒酸氫鈉，使用時候要注意安全，當天使用當天配置。)合用可獲得更高的檢出率。
沙門氏菌在BS瓊脂上的菌落形態(tài)：產(chǎn)H2S的菌落為黑色有金屬光澤、棕褐色或灰色。菌落周圍培養(yǎng)基可呈黑色或棕色，有些不產(chǎn)H2S的菌落，形成灰綠的菌落，周圍培養(yǎng)基不變。
②HE瓊脂中的膽鹽、去氧膽酸鈉、溴麝香草酚蘭和酸性復紅抑制革蘭氏陽性菌生長；硫代硫酸鈉和檸檬酸鐵銨用于檢測H2S的產(chǎn)生，使菌落中心呈黑色;溴麝香草酚蘭和酸性復紅為pH指示劑，發(fā)酵糖產(chǎn)酸的菌落呈橙-黃色，不發(fā)酵糖的菌落為藍綠色。
注意
HE不能高壓滅菌，煮沸不能超過1min，水浴中冷卻，只能保存一天。
沙門氏菌在HE瓊脂上的菌落形態(tài)：藍綠色或藍色，多數(shù)菌株產(chǎn)H2S，中心呈黑色或幾乎全黑色。有些菌株為黃色，中心呈黑色或幾乎全黑色。
③XLD瓊脂中的去氧膽酸鈉抑制革蘭氏陽性菌生長，在此濃度下也同時作為大腸埃希氏菌的抑制劑但不影響沙門氏菌和志賀菌屬的生長的生長；硫代硫酸鈉可被某些細菌還原成H2S，與檸檬酸鐵銨中的鐵鹽生成黑色硫化鐵。
注意
XLD平板培養(yǎng)基不能高壓，不能過熱煮沸，保存一天。XLD培養(yǎng)基分離沙門氏菌和志賀菌的敏感性超過了傳統(tǒng)的培養(yǎng)基，如：EMB、SS、BS。因這些培養(yǎng)基尚有抑制志賀菌屬生長的潛在因素，故本培養(yǎng)基是分離鑒定沙門氏菌及志賀菌屬的可靠培養(yǎng)基。在國外廣泛使用。
沙門氏菌在XLD平板培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)：粉紅色帶或不帶黑色中心，有些菌株可呈現(xiàn)大的帶光澤的黑色中心或呈現(xiàn)全部黑色的菌落；有些菌落為黃色，帶或不帶黑色中心。
④沙門氏菌顯色培養(yǎng)基主要用于快速篩選、分離沙門氏菌。其基本原理是利用沙門氏菌特異性酶與顯色基團的特有反應，使色原游離出來，從而使沙門氏菌在培養(yǎng)基上呈現(xiàn)特定的顏色(具體顏色查看相關品牌顯色培養(yǎng)基使用說明書)而大腸桿菌等其他腸道桿菌呈其他顏色。
四．沙門氏菌檢測過程中的注意事項和常見問題
1.前增菌和二次增菌都是必不可少的過程。
食品中的沙門氏菌含量一般都很少并且會有多種細菌同時存在的情況，前增菌可以使受傷菌得到修復而增菌可以抑制一些雜菌的生長，所以沙門氏菌檢測用前增菌和增菌分別進行篩選和培養(yǎng)，可以增加后期分離培養(yǎng)的檢出率。
2.在沙門氏菌檢測分離培養(yǎng)中應注意當不存在典型的或可疑的沙門氏菌菌落時，按如下步驟檢驗非典型的沙門氏菌菌落。
HE和XLD：非典型的沙門氏菌在HE和XLD瓊脂上呈黃色菌落，帶或不帶黑色中心。HE和XLD平板經(jīng)24±2小時培養(yǎng)后，沒有典型的沙門氏菌菌落，則挑取2個或更多個非典型的沙門氏菌菌落。
BS瓊脂：某些非典型菌株產(chǎn)生綠色菌落，其周圍培養(yǎng)基稍微或不呈暗色。如果BS平板培養(yǎng)24±2小時后，沒有出現(xiàn)典型菌落，則不挑取任何菌落讓平板繼續(xù)培養(yǎng)24±2小時。如果經(jīng)48±2小時培養(yǎng)后，仍沒有典型或可疑菌落出現(xiàn)，則挑取2個或更多個非典型的菌落。
3.TSI要制備成高柱斜面，有助于結果判讀，實驗時應先劃線再穿刺，先穿刺再劃線可能會導致含菌量太高。
如果產(chǎn)H2S變黑，難以觀察底層的產(chǎn)酸現(xiàn)象，并且如果產(chǎn)氣較多的話培養(yǎng)基會被頂出很高更有甚者可能會頂開試管塞。典型沙門氏菌在TSI上斜面呈紅色，底端呈黃色，有氣體產(chǎn)生，90%形成H2S，瓊脂變黑。但對于乳糖陽性的沙門氏菌斜面也呈黃色，因此不能僅僅根據(jù)三糖鐵培養(yǎng)的結果就確認沙門氏菌。
4.目前沒有一種培養(yǎng)基能準確無誤的篩選出沙門氏菌，因此必須選擇多種選擇性培養(yǎng)基同時進行篩選。
顯色培養(yǎng)基只是綜合選擇性更強，實驗人員不能只在選擇性培養(yǎng)基和TSI 特征符合而沒有把關鍵的生化反應和血清學鑒定完成的情況下就報結果，這樣很可能導致結果假陽性。
5.血清學鑒定是沙門氏菌檢驗中的重要鑒定方法。
包括菌體抗原(O)鑒定、鞭毛抗原(H)鑒定和Vi抗原鑒定。血清檢測時要使用24h內(nèi)的純菌，在規(guī)定時間內(nèi)觀察結果，并做自凝實驗。凝集不好的室溫(不要放冰箱)放置1-2天或者傳代一次再凝集，可能凝集的情況會好些。如果實驗室條件許可建議購置進口血清(以泰國和丹麥血清為佳)，如果用國產(chǎn)血清盡量同時使用兩種廠家產(chǎn)品互相驗證。
6.沙門氏菌結果判定應該以生化試驗結果為主并在此基礎上進行血清學判定。
直接用多價血清進行試驗而不進行生化試驗是絕對不可取的。因為血清學的原理是抗原抗體結合，非沙門氏菌的微生物也有可能帶有沙門的類似抗原，這樣的操作可能會導致假陽性因此我們做鑒定的時候必須先進行生化試驗，再在生化試驗的基礎上進行血清學鑒定。
7.如果我們只需要鑒定某個菌株是否屬于沙門氏菌，那只需要做O多價和H多價血清就可以了(大多數(shù)食源性沙門氏菌凝集A-F群O多價)。
如果要鑒定某個菌株具體是什么沙門氏菌，那就需要進行血清學分型試驗，從多價血清一直做到O抗原和H抗原的單因子，然后參照《GB 4789.4-2016 食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 沙門氏菌檢驗》附錄B的表格查找對應的沙門氏菌名。
8.在做血清學鑒定時O多價血清如果沒有凝集并不能直接判定為陰性，因為還要考慮Vi抗原的影響。
Vi抗原屬于K抗原群會阻隔O抗原和相應抗體的結合，所以當Vi抗原存在時，O多價血清是不會凝集的。因此必須去除Vi抗原的影響。具體方法是挑取菌苔于1ml生理鹽水中做成濃菌液，于酒精燈火焰上煮沸后再檢查如果還是不凝集，才能判定為陰性。
