GB4789.3-2016大腸菌群平板計數(shù)法細(xì)節(jié)解讀
發(fā)布時間：2019-10-31 瀏覽次數(shù)：17365
1.所用器皿是否需要滅菌？
答：不需要。配制培養(yǎng)基所用到的錐形瓶、玻璃棒、勺子等均不需要滅菌，但要求一定要清洗干凈，表面無污漬、無殘留，且晾干無水漬。煮沸完成后，取下錐形瓶，用一般用錫箔紙覆蓋瓶口，用橡皮筋纏繞，待冷卻至適宜溫度即可傾注培養(yǎng)基。在傾注培養(yǎng)基時，須點燃酒精燈，稍微灼燒錐形瓶口。
2.如何保持培養(yǎng)基“煮沸2min”？
答：培養(yǎng)基加熱煮沸至完全溶解一般采用電陶爐或電熱爐進(jìn)行，但培養(yǎng)基很難保持煮沸2min，一旦煮沸，則培養(yǎng)基很快上涌、翻騰，若不調(diào)低溫度或立刻采取其他措施，則培養(yǎng)基可在數(shù)秒內(nèi)噴涌出來，嚴(yán)重者可噴涌2米以上、電磁爐周圍1—2米范圍內(nèi)都是培養(yǎng)基飛濺的范圍（實驗室危險因子之一）。因此，要做到“煮沸2min”，則需在該培養(yǎng)基即將煮沸時調(diào)低溫度，待培養(yǎng)基一沸騰就馬上移離熱源，待培養(yǎng)基停止沸騰后，又繼續(xù)加熱至沸騰狀態(tài)又移開，這樣間歇性煮沸2min。（注意規(guī)范操作，做好防燙措施，避免燙傷）
3.若培養(yǎng)基未用完，是否可以冷藏起來下次用？
答：不可以。4789.28中已規(guī)定，固體培養(yǎng)基最多允許熔融1次（指的是經(jīng)過高壓滅菌冷卻后的培養(yǎng)基還可以熔融一次后使用）。且VRBA培養(yǎng)基冷卻后，再次熔融時非常容易噴涌，若溫度控制不當(dāng)，底部培養(yǎng)基熔融后很快就會發(fā)生噴涌。
4.傾注完成后是否需要“覆蓋一層”？如何覆蓋？
答：需要覆蓋。因為培養(yǎng)基冷卻后在表面容易形成一些冷凝水，菌落容易蔓延開，所以在傾注完成后，再覆蓋一層培養(yǎng)基，則菌落不容易接觸到水，這樣不易形成蔓延菌落。在檢驗中最好都進(jìn)行覆蓋，最好是在原培養(yǎng)基已凝固或半凝固（不會發(fā)生晃動）時再傾注一層培養(yǎng)基（“一層”是指緩慢傾注培養(yǎng)基至培養(yǎng)基剛好能夠覆蓋整個平皿）。
二、如何確定培養(yǎng)基上長的是不是大腸菌群？
答：不要去管什么是大腸菌群的典型形態(tài)，建議新手們認(rèn)真按照標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行證實試驗，此證實試驗非常簡單，每一次VRBA上有菌落生長都進(jìn)行證實試驗，如此往復(fù)3-4次，對于哪種形態(tài)才是大腸菌群已經(jīng)能夠了然于心了。建議平時多配一些BGLB肉湯管冷藏儲存?zhèn)溆茫枰M(jìn)行證實試驗時分分鐘可以完成試驗。
三、兩個梯度都長了菌，如何選?。咳绾芜M(jìn)行證實試驗？菌落選取數(shù)量？
答：選取15-150CFU之間的平板（指的是VRBA平板上所有菌落數(shù)在此范圍），挑取可疑菌落進(jìn)行證實試驗。詳細(xì)舉例說明：若有兩個連續(xù)梯度的4個平板上菌落數(shù)均在15-150之間，則4個平板上的菌落都要挑取進(jìn)行證實試驗，實際操作時，可靈活操作，如：1:10的兩個平板上的菌落數(shù)分別為120、123，1:100的兩個平板的菌落數(shù)分別為16、18，嚴(yán)格來講必須至少在每個平板上分別挑取5個可疑菌落、5個典型菌落進(jìn)行證實試驗。建議使用鎳合金接種環(huán)（即傳統(tǒng)的接種環(huán)，而不是一次性塑料接種環(huán)），因為VRBA上生長的菌落（無論典型或可疑）大部分長在底層、且菌落一般較大，被培養(yǎng)基覆蓋，傳統(tǒng)的接種環(huán)較細(xì)，用以刮去上層培養(yǎng)基較方便，挑取菌落也較方便。
確證試驗注意：1）.每種可疑菌落挑取5個，每個菌落放入1管GBLB管中；2）“產(chǎn)氣者，記為大腸菌群陽性管”，就要求在實驗前須認(rèn)真篩選BGLB管，凡小導(dǎo)管中有氣泡的GBLB管應(yīng)先排去導(dǎo)管中的氣泡再使用。
VRAB平板上典型大腸菌群菌落形態(tài)
BGLB確證陽性結(jié)果
四、結(jié)果如何計算？
答：首先，在VRBA培養(yǎng)24h后進(jìn)行計數(shù)，分別計數(shù)可疑大腸菌群和典型大腸菌群的數(shù)量。例：10-4樣品稀釋液1mL，在VRBA平板上有100個典型和可疑菌落，挑取其中10個接種BGLB肉湯管，證實有6個陽性管，則該樣品的大腸菌群數(shù)為：100*6/10*104/g（mL）=6.0*105 CFU/g（mL）。若所有稀釋度（包括液體樣品原液）平板均無菌落生長，則以小于1乘以最低稀釋倍數(shù)計算。
五、若所選適合計數(shù)梯度平板上可疑和典型菌落，最終證實全部為陰性，結(jié)果如何計算？
答：根據(jù)第3條,選取適宜菌落數(shù)的平板挑取菌落進(jìn)行證實試驗，若證實全部為陰性，則需要再挑取更低稀釋度的平板上的菌落（建議可疑和典型菌落分別挑取10個）進(jìn)行證實試驗，若第二次證實試驗均呈陰性，以＜1乘以最低稀釋度進(jìn)行計算，如：1:10的平板菌落數(shù)分別為120、123，1:100的平板上菌落數(shù)分別為16、18，首先挑取1:100的兩個平板上的菌落進(jìn)行證實試驗，若全部為陰性，再挑取1:10的兩個平板上的菌落進(jìn)行證實試驗，若1:10的平板上的菌落數(shù)證實為陰性，則最終計算過程為＜1x10，最終結(jié)果為＜10；若1:10的的平板上的菌落有陽性管，則按照第5條進(jìn)行計算。
