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隨著人們生活水平的提高，我國(guó)乳制品行業(yè)也在快速發(fā)展，因此乳制品的食品安全日益成為公眾關(guān)注的焦點(diǎn)。單核細(xì)胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)簡(jiǎn)稱單增李斯特菌，是牛奶和乳制品中威脅人類健康的主要病原菌之一，也國(guó)際上公認(rèn)的李斯特菌十個(gè)菌株中唯一能引起嚴(yán)重食物中毒的菌株。該菌在冰箱冷藏室內(nèi)這種較低溫度的環(huán)境下長(zhǎng)時(shí)間生長(zhǎng)繁殖，對(duì)廣大的奶制品消費(fèi)群體產(chǎn)生潛在的健康威脅，因此，必須對(duì)其檢測(cè)加以重視。
廣東環(huán)凱微生物科技有限公司長(zhǎng)期從事微生物控制和檢測(cè)的相關(guān)研究，是我國(guó)最早研究、開(kāi)發(fā)食品微生物安全檢測(cè)產(chǎn)品的廠家之一，對(duì)微生物檢測(cè)試劑有著成熟的研發(fā)及生產(chǎn)經(jīng)驗(yàn)。我公司針對(duì)目前乳制品行業(yè)及質(zhì)量監(jiān)測(cè)單位對(duì)單增李斯特菌快速檢測(cè)的需求及情況，特別從英國(guó)公司Microgen Bioproducts引進(jìn)了HK-MID李斯特氏菌生化鑒定系統(tǒng)，使得單增李斯特菌檢驗(yàn)方式較之前有很大的改進(jìn)，使得技術(shù)操作人員能更準(zhǔn)確、快捷的檢測(cè)出目標(biāo)菌。
HK-MID李斯特氏菌生化鑒定系統(tǒng)（也稱為Microgen Listeria-ID鑒定系統(tǒng)），相對(duì)于傳統(tǒng)的生理生化檢驗(yàn)， 具有三大特點(diǎn)。
1）操作方便：無(wú)需配制溶液或試劑，占用體積小。
2）反應(yīng)時(shí)間短：接種后的鑒定條培養(yǎng)18-24小時(shí)后通過(guò)肉眼可見(jiàn)的顏色變化記錄結(jié)果（無(wú)需額外添加任何試劑）
3）判定簡(jiǎn)單快速：無(wú)需對(duì)照相關(guān)書籍或標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行菌株鑒別判定，通過(guò)購(gòu)買產(chǎn)品后贈(zèng)送的Microgen鑒定系統(tǒng)軟件分析即可得到鑒定結(jié)果。
其創(chuàng)新性在于將可疑菌株產(chǎn)生的生化反應(yīng)與菌種生化反應(yīng)數(shù)據(jù)庫(kù)中的大量菌株的生化反應(yīng)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，依靠統(tǒng)計(jì)學(xué)原理，對(duì)少數(shù)由細(xì)小表達(dá)突變或?qū)嶒?yàn)操作因素導(dǎo)致的不確定結(jié)果進(jìn)行合理判斷，最終從數(shù)據(jù)庫(kù)中調(diào)出可能性最大的菌株數(shù)據(jù)與其進(jìn)行匹配，避免了傳統(tǒng)方法中由菌株因個(gè)別實(shí)驗(yàn)結(jié)果差異導(dǎo)致的結(jié)果無(wú)法判定。
目前的分子學(xué)方法，雖然在操作上十分快速，但判定依據(jù)不明確，生物和技術(shù)上的變化性直接限制了分子分型方法的可重復(fù)性，而這反過(guò)來(lái)限制了它的分辨力；同時(shí)目前成本較高，無(wú)法進(jìn)行推廣普及。
每條Microgen Listeria-ID鑒定條包括11份干燥反應(yīng)底物和1個(gè)空管，反應(yīng)底物主要用來(lái)檢驗(yàn)培養(yǎng)物對(duì)碳水化合物的利用，空管則用于溶血試驗(yàn).
HK-MID李斯特氏菌生化鑒定系統(tǒng)使用方案
以GB 4789.30-2010 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢驗(yàn)流程為例（或其他標(biāo)準(zhǔn)的檢驗(yàn)流程）,將可疑菌落篩選出后，用TSA-YE平板劃線純化。如下圖中的初篩步驟。
國(guó)標(biāo)中涉及到的培養(yǎng)基及試劑可參考
在對(duì)可疑菌株進(jìn)行純化后。圖2紅色方框中的鑒定步驟可用下列鑒定方法進(jìn)行替代，以達(dá)到簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)，減少工作量的目的。
首先，必須確認(rèn)可疑菌株為李斯特氏菌屬。
1：李斯特氏菌屬鑒定（如實(shí)驗(yàn)安排合理，可當(dāng)天觀察到結(jié)果）
1.1：革蘭氏染色實(shí)驗(yàn)。
1.2：氧化酶實(shí)驗(yàn)。
1.3：觸酶（過(guò)氧化氫酶）實(shí)驗(yàn)
1.4：動(dòng)力實(shí)驗(yàn)（25 ℃和37 ℃）。在圖1中初篩步驟劃線TSA-YE的同時(shí)接種半固體瓊脂做動(dòng)力實(shí)驗(yàn)，通過(guò)此步，可在后一天協(xié)同其他實(shí)驗(yàn)共同確定是否是李斯特軍屬。
如仍然不能確定，可使用李斯特氏菌乳膠凝集試劑進(jìn)行確定。
上述四個(gè)步驟的實(shí)驗(yàn)用品不包含在HK-MID李斯特氏菌生化鑒定系統(tǒng)的鑒定條中需另外購(gòu)置
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貨號(hào) |
產(chǎn)品名稱 |
規(guī)格 |
類別 |
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029010 |
革蘭氏染色液 |
10 ml×4瓶 |
盒 |
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029170 |
氧化酶試紙 |
10片/盒 |
盒 |
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029161 |
過(guò)氧化氫酶試劑 |
2 mL/支×10 |
盒 |
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026050 |
半固體瓊脂 |
250g |
瓶（干粉） |
|
075350A |
半固體瓊脂 |
10 ml×20支 |
盒（管裝） |
|
075350 |
半固體瓊脂 |
20支 |
盒（西林瓶） |
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HM 48 |
李斯特氏菌乳膠凝集試劑盒 |
50 tests |
盒 |
此五個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果：革蘭氏陽(yáng)性短桿菌，氧化酶陰性，觸酶陽(yáng)性，在25℃培養(yǎng)具有動(dòng)力，但在37℃培養(yǎng)則無(wú)動(dòng)力，可確認(rèn)其為李斯特氏菌屬。之后，使用HK-MID李斯特氏菌生化鑒定系統(tǒng)對(duì)對(duì)可疑菌進(jìn)行進(jìn)一步鑒定。
2：HK-MID李斯特氏菌生化鑒定系統(tǒng)使用方法
2.1：試劑條使用說(shuō)明
1）菌懸液制備好后，用無(wú)菌滴管加4滴（約100微升）菌懸肉湯至每個(gè)反應(yīng)小管；
2）向管12中加入1滴溶血素試劑；
3）用粘性封口膜或鑒定條蓋封口，放至35-37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18-24小時(shí)。
2.2：結(jié)果觀察
培養(yǎng)結(jié)束后，對(duì)應(yīng)反應(yīng)結(jié)果對(duì)照表（說(shuō)明書背面）讀取結(jié)果，填寫在結(jié)果記錄報(bào)告單上。
注：溶血素實(shí)驗(yàn)結(jié)果：檢查小管的底部，若覆蓋著一層清晰的血紅細(xì)胞，而底部血紅細(xì)胞層上方呈現(xiàn)透明的溶液結(jié)果為陰性 ；若底部無(wú)清晰的血紅細(xì)胞層，上方出現(xiàn)黃褐色的均勻溶液，則結(jié)果為陽(yáng)性。
2.3：軟件使用
在鑒定結(jié)果記錄表中，所有反應(yīng)都被分配在三元組中（三個(gè)反應(yīng)為一組），每個(gè)反應(yīng)下面均標(biāo)有對(duì)應(yīng)的數(shù)值1、2、4，將每組中陽(yáng)性反應(yīng)對(duì)應(yīng)的數(shù)值加起來(lái)將得到一個(gè)四位數(shù)，作為信息代碼（Octal Code），將這個(gè)信息代碼輸入Microgen鑒定軟件系統(tǒng)中，系統(tǒng)將顯示出數(shù)據(jù)庫(kù)中5個(gè)最接近結(jié)果的菌種，從而得到鑒定結(jié)果。
詳細(xì)的MID鑒定系統(tǒng)使用方法，參見(jiàn)
總結(jié)：使用該鑒定方案，可以從原來(lái)的至少2 天（最長(zhǎng)4天）的鑒定時(shí)間，縮短到1天（總體李斯特氏菌篩選檢驗(yàn)的時(shí)間由6~10天縮短到5~7天），為企業(yè)的生產(chǎn)爭(zhēng)取了寶貴的時(shí)間。
