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檢驗(yàn)流程及注意事項(xiàng)
? 1、樣品制備
◆ 固體和半固體樣品：稱取25g樣品，加入225mL無(wú)菌稀釋液（滅菌蒸餾水或生理鹽水或磷酸緩沖液），充分振搖，或用拍擊式均質(zhì)器拍打1 min 到2 min，制成1：10的樣品勻液。
◆ 液體樣品：以無(wú)菌吸管吸取25mL樣品至225mL無(wú)菌稀釋液（滅菌蒸餾水或生理鹽水或磷酸緩沖液）的適宜容器內(nèi)（可在瓶?jī)?nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的無(wú)菌玻璃珠）或無(wú)菌均質(zhì)袋中），充分振搖，或用拍擊式均質(zhì)器拍打1 min 到2 min，制成1：10的樣品勻液。
◆ 取1mL 1:10稀釋液注入含有9mL無(wú)菌水的試管中, 另?yè)Q一支1mL無(wú)菌吸管反復(fù)吹吸，或在螺旋混合器上混勻，此液為1:100稀釋液。
? 2、接種及培養(yǎng)
◆ 根據(jù)對(duì)樣品污染狀況的估計(jì)，選擇2個(gè)～3個(gè)適宜稀釋度的樣品勻液（液體樣品可包括原液），在進(jìn)行10倍遞增稀釋的同時(shí)，每個(gè)稀釋度分別吸取1mL樣品勻液于2個(gè)無(wú)菌平皿內(nèi)。同時(shí)分別取1mL樣品稀釋液加入2個(gè)無(wú)菌平皿作空白對(duì)照（用于監(jiān)測(cè)培養(yǎng)基、稀釋液、平皿、吸管及操作環(huán)境保證實(shí)驗(yàn)的有效性）。
◆ 及時(shí)將 20mL～25mL（用量增加，防止水分過(guò)度蒸發(fā)影響生長(zhǎng)率）冷卻至46℃的馬鈴薯葡萄糖瓊脂或孟加拉紅瓊脂傾注平皿，并轉(zhuǎn)動(dòng)平皿使其混合均勻。至水平臺(tái)面待培養(yǎng)基完全凝固。
◆ 傾注凝固后，正置平板，28℃±1℃，觀察并記錄培養(yǎng)至第5d的結(jié)果。
關(guān)于正置培養(yǎng)的討論
1、為水分蒸發(fā)導(dǎo)致蓋子內(nèi)面產(chǎn)生水珠，影響觀察，同時(shí)平板邊緣開(kāi)裂
2、孢子飄散導(dǎo)致計(jì)數(shù)不準(zhǔn)
3、孢子污染培養(yǎng)箱
實(shí)際上在28℃下，平板的水分并不會(huì)蒸發(fā)的十分強(qiáng)烈，而且平板內(nèi)部冷凝水產(chǎn)生一般是由于較大的溫度波動(dòng)，此時(shí)需要考慮的是培養(yǎng)箱放置房間的溫度控制及培養(yǎng)箱的密封性。平板的開(kāi)裂有兩個(gè)因素，一個(gè)是失水過(guò)多，第二個(gè)是因?yàn)槠桨宀牧吓c培養(yǎng)基比熱相差較大（玻璃平皿較容易出現(xiàn)），熱脹冷縮導(dǎo)致的瓊脂塊與平板分離。關(guān)于玻璃平皿還有其他的一些問(wèn)題：因生產(chǎn)廠家的不同及不同廠家的品種參次不齊，玻璃平皿蓋底不和，縫隙較大，風(fēng)機(jī)的空氣壓力易導(dǎo)致皿內(nèi)真菌孢子的脫落，及培養(yǎng)箱污染。因此建議用一次性平皿，同時(shí)對(duì)培養(yǎng)間的溫度控制，挑選購(gòu)買培養(yǎng)箱的時(shí)候注意其密封性。
? 3、培養(yǎng)基的使用（兩種任選一種）
 |  |
| PDA平板 | 孟加拉紅平板 |
◆ 兩種培養(yǎng)基都含有氯霉素，可以抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)；
◆ 對(duì)氯霉素耐藥的一些細(xì)菌在這兩種培養(yǎng)基上也生長(zhǎng)，可以通過(guò)菌落形態(tài)來(lái)區(qū)分，或者通過(guò)染色鏡檢來(lái)判定；
◆ 如果需要分開(kāi)報(bào)告霉菌和酵母菌的數(shù)量，主要通過(guò)菌落形態(tài)來(lái)區(qū)分。
細(xì)菌、酵母菌及霉菌的不同菌落形態(tài)
◆ 細(xì)菌：由于細(xì)胞小，形成的菌落較小，較薄、較透明、且有“細(xì)膩感”。可產(chǎn)生不同色素，菌落可呈現(xiàn)五顏六色且形態(tài)多樣。
◆ 酵母菌：由于細(xì)胞較大且不能運(yùn)動(dòng)，一般菌落比細(xì)菌大、厚且透明度差。產(chǎn)生色素較單一，通常乳白色，少數(shù)為橙紅色，個(gè)別黑色。
◆ 霉菌：菌落形態(tài)較大，質(zhì)地疏松，外觀干燥，不透明，呈現(xiàn)蛛網(wǎng)狀、絨毛狀、棉絮狀或氈狀；菌落與培養(yǎng)基間的聯(lián)系緊密，不易挑起，菌落正面與反面、邊緣與中心的顏色和構(gòu)造常不一致。
細(xì)菌、酵母菌及霉菌在電鏡及顯微鏡下的形態(tài)
霉菌：細(xì)胞構(gòu)造與酵母菌相似，但外觀以菌絲體形式存在。
酵母菌：細(xì)胞通常有球狀、卵圓狀、橢圓狀、柱狀和香腸狀。
? 4、計(jì)數(shù)
◆ 計(jì)算統(tǒng)一稀釋度的兩個(gè)平板菌落數(shù)的平均值，再將平均值乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)。
◆ 若有兩個(gè)稀釋度平板上菌落數(shù)均在10-150CFU，則按照 GB4789.2 的相應(yīng)規(guī)定進(jìn)行計(jì)數(shù)。
◆ 若所有平板上菌落數(shù)均大于150CFU，則對(duì)稀釋度最高的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)，其他平板可記錄為多不可計(jì)，結(jié)果按平均菌落數(shù)乘以最高稀釋倍數(shù)計(jì)算。
◆ 若所有平板上菌落數(shù)均小于10CFU，則應(yīng)按稀釋度最低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)計(jì)算。
◆ 若所有稀釋度（包括液體樣品原液）平板均無(wú)菌落生長(zhǎng)，則以小于1乘以最低稀釋倍數(shù)計(jì)算。
◆ 若所有稀釋度平板的菌落數(shù)均不在10-150CFU之間，其中一部分小于10CFU或大于150CFU,則以最接近10或150CFU的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)做計(jì)算。
? 5、結(jié)果報(bào)告
◆ 菌落數(shù)按“四舍五入”原則修約。菌落數(shù)在10以內(nèi)時(shí)，采用一位有效數(shù)字報(bào)告；菌落數(shù)在10-100之間時(shí)，采用兩位有效數(shù)字報(bào)告。
◆ 菌落數(shù)大于或等于100時(shí)，前3位數(shù)字采用“四舍五入”原則修約后，取前2位數(shù)字，后面用0代替位數(shù)來(lái)表示結(jié)果；也可用10的指數(shù)形式來(lái)表示，此時(shí)也按“四舍五入”原則修約，采用兩位有效數(shù)字。
◆ 若空白對(duì)照平板上有菌落出現(xiàn)，則此次檢測(cè)結(jié)果無(wú)效。
◆ 稱重取樣以CFU/g為單位報(bào)告，體積取樣以CFU/mL為單位報(bào)告，報(bào)告或分別報(bào)告霉菌和/或酵母數(shù)。
過(guò)程中所用到的培養(yǎng)基項(xiàng)
| 貨號(hào) | 名稱 | 規(guī)格 |
| 21050 | 馬鈴薯葡萄糖瓊脂 (PDA) | 250g/瓶 |
| CP0010 | 馬鈴薯葡萄糖瓊脂 (PDA)平板 | 90mm×20個(gè) |
| 21010 | 孟加拉紅培養(yǎng)基(虎紅瓊脂) | 250g/瓶 |
| 021010B | 孟加拉紅 (虎紅)瓊脂平板 | 90mm×20個(gè) |
| 021010P1 | 孟加拉紅培養(yǎng)基（虎紅瓊脂） | 250g/瓶 |
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