微生物種類繁多，數(shù)量龐大，但它們既微小又透明，我們根本沒(méi)法看清楚，更別說(shuō)研究它們。要想觀察細(xì)菌，必須采用特殊的染色方法將微生物著色，這樣既方便觀察也便于鑒別菌種。

細(xì)菌染色法是為了便于觀察和研究而利用有關(guān)染料使細(xì)菌細(xì)胞著色的方法。細(xì)菌染色方法很多，根據(jù)不同的目的采用不同染色方法。細(xì)菌染色法作為微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中最為基礎(chǔ)的技術(shù)，在實(shí)驗(yàn)室過(guò)程中廣泛使用，所以學(xué)會(huì)細(xì)菌染色是進(jìn)入微生物實(shí)驗(yàn)室的第一步。

正染色是強(qiáng)化標(biāo)本的結(jié)構(gòu)，即染色劑與樣品結(jié)合，增強(qiáng)其散射電子的能力，最終在熒光屏上形成正象。

負(fù)染色是將標(biāo)本包埋在染色物質(zhì)里，借助染色劑增強(qiáng)背景對(duì)電子散射的作用，而標(biāo)本在熒光屏上形成暗背景下的亮，故又稱“襯托染色法”、“間接染色法”。

在負(fù)染色法中，標(biāo)本不需要熱固定，細(xì)胞不會(huì)因?yàn)榛瘜W(xué)藥物的影響而變形，對(duì)于不易染色的細(xì)菌或病毒也能觀察。

接下來(lái)，按照實(shí)驗(yàn)原理、實(shí)驗(yàn)步驟、注意事項(xiàng)以及疑難解答等幾個(gè)方面向各位小伙伴們一一進(jìn)行詳細(xì)闡述。

一、簡(jiǎn)單染色法

簡(jiǎn)單染色法，又叫單染色法，就是使用一種染料對(duì)細(xì)菌染色的方法，是實(shí)驗(yàn)室常用的一種染色技術(shù)，主要用于觀察細(xì)菌的形態(tài)和大小，但不能用于鑒別細(xì)菌。

1、實(shí)驗(yàn)原理：主要基于細(xì)菌細(xì)胞在特定條件下的表面電荷性質(zhì)和染料的化學(xué)性質(zhì)。

1）在中性、堿性或弱酸性溶液中，細(xì)菌細(xì)胞通常帶負(fù)電荷，而常用的堿性染料（如美藍(lán)、結(jié)晶紫、堿性復(fù)紅、沙黃、孔雀綠等）在電離時(shí)，其染色部分帶正電荷。因此，這些堿性染料的染色部分很容易與帶負(fù)電荷的細(xì)菌結(jié)合，使細(xì)菌著色。
2）利用單一染料對(duì)細(xì)菌進(jìn)行染色，染色后的細(xì)菌細(xì)胞與背景形成鮮明的對(duì)比，從而更清楚地觀察到細(xì)菌的形態(tài)和結(jié)構(gòu)。

2、染液的配制

1）結(jié)晶紫液：結(jié)晶紫乙醇飽和液(結(jié)晶紫2g溶于20mL95%乙醇中)20mL，1%草酸銨水溶液80mL，將兩液混勻置24h后過(guò)濾即成。 
2）番紅溶液：番紅O2.5g，95%乙醇100mL，溶解后可貯存于密閉的棕色瓶中，用時(shí)取20mL與80mL蒸餾水混勻即可。

3、應(yīng)用：簡(jiǎn)單染色法操作簡(jiǎn)便，適用于菌體的一般形態(tài)和排列的觀察。

4、實(shí)驗(yàn)步驟
1）準(zhǔn)備。一般載玻片浸泡在酒精中清洗油漬，在實(shí)驗(yàn)之前，用鑷子取出，在酒精燈火焰上方灼燒一下，去除酒精。
2）涂片。在潔凈的載玻片上滴加一滴無(wú)菌水，然后用無(wú)菌接種環(huán)挑取適量細(xì)菌懸浮液并涂成薄膜。
3）固定。在酒精燈上方加熱，但要注意溫度不要過(guò)高，以免破壞細(xì)菌的形態(tài)，手指輕叩微燙即可。也可以使用化學(xué)固定劑（如甲醛）來(lái)固定細(xì)菌，以確保細(xì)菌的形態(tài)不受損失。
4）染色。滴加染液覆蓋涂片，讓細(xì)菌與染液充分接觸，通常染色時(shí)間為1-3min。
5）沖洗。用洗瓶沖洗涂片，直到流出的水中無(wú)染液顏色為止。
6）干燥。將涂片自然晾干或用吸水紙輕輕吸干。
7）鏡檢。使用顯微鏡觀察細(xì)菌的形態(tài)和結(jié)構(gòu)。

5、影響因素及注意事項(xiàng)

1）涂片：厚度不合適，過(guò)厚或過(guò)薄都會(huì)影響觀察。涂片不均勻，染色不均勻，深淺不一，影響觀察效果。
2）固定：微熱即可，不需要太熱，菌體形態(tài)容易改變。
3）染色：染色時(shí)間的長(zhǎng)短要靈活掌握，不能死記時(shí)間，要根據(jù)染液濃度和涂片的厚度適當(dāng)調(diào)整。到處需要積累經(jīng)驗(yàn)沒(méi)辦法。
4）染色過(guò)程中勿使染色液干涸。
5）涂片須完全干燥后才能用油浸物鏡觀察。

二、革蘭氏染色法

革蘭氏染色法（Gram Staining）是細(xì)菌學(xué)中廣泛使用的一種鑒別染色法，1884年由丹麥醫(yī)師漢斯·克里斯蒂安·革蘭(Hans Christian Gram，1853年-1938年)創(chuàng)立。

未經(jīng)染色的細(xì)菌，由于其與周圍環(huán)境折光率差別甚小，故在顯微鏡下極難觀察。染色后細(xì)菌與環(huán)境形成鮮明對(duì)比，可以清楚地觀察到細(xì)菌的形態(tài)、排列及某些結(jié)構(gòu)特征，而用以分類鑒定，革蘭氏染色屬于復(fù)染法。

這種染色法利用細(xì)菌細(xì)胞壁上的生物化學(xué)性質(zhì)不同，將細(xì)菌分成兩類，即革蘭氏陽(yáng)性（Gram Positive，G+）與革蘭氏陰性（Gram Negative，G-）。

1、實(shí)驗(yàn)原理：通過(guò)結(jié)晶紫初染和碘液媒染后，在細(xì)胞壁內(nèi)形成了不溶于水的結(jié)晶紫與碘的復(fù)合物，革蘭氏陽(yáng)性菌由于其細(xì)胞壁較厚、肽聚糖網(wǎng)層次較多且交聯(lián)致密，故遇乙醇或丙酮脫色處理時(shí)，因失水反而使網(wǎng)孔縮小，再加上它不含類脂，故乙醇處理不會(huì)出現(xiàn)縫隙，因此能把結(jié)晶紫與碘復(fù)合物牢牢留在壁內(nèi)，使其仍呈紫色；而革蘭氏陰性菌因其細(xì)胞壁薄、外膜層類脂含量高、肽聚糖層薄且交聯(lián)度差，在遇脫色劑后，以類脂為主的外膜迅速溶解，薄而松散的肽聚糖網(wǎng)不能阻擋結(jié)晶紫與碘復(fù)合物的溶出，因此通過(guò)乙醇脫色后仍呈無(wú)色，再經(jīng)沙黃等紅色染料復(fù)染，就使革蘭氏陰性菌呈紅色。

2、染液的配制

1）結(jié)晶紫液：同上。
2）盧戈氏碘液：碘0.33g，碘化鉀0.66g，蒸餾水100mL。先將碘化鉀溶于少量蒸餾水中，然后加入碘使之完全溶解，再加蒸餾水至100mL即成。配成后貯于棕色瓶?jī)?nèi)備用，如變?yōu)辄S色即不能使用。 
3）95%乙醇：用于脫色
4）番紅溶液：同上。

3、應(yīng)用：應(yīng)用于細(xì)菌檢測(cè)，細(xì)菌的鑒別和分類，病毒的檢測(cè)以及生物樣品的特性分析。

4、實(shí)驗(yàn)步驟（革蘭氏染色法一般包括初染、媒染、脫色、復(fù)染等四個(gè)步驟，具體操作方法如下）：

1）制片：固定，操作同上；
2）初染：滴加草酸銨結(jié)晶紫染色1min，水洗；
3）媒染：滴加革蘭氏碘液（碘-碘化鉀溶液）染色1min，水洗；
4）脫色：滴加體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇，約45s后水洗；
5）復(fù)染：滴加番紅染液染色3min，水洗并使之干燥；
6）鏡檢：革蘭氏陽(yáng)性菌呈紫色，革蘭氏陰性菌呈紅色。

5、影響因素及注意事項(xiàng)

1）選用活躍生長(zhǎng)期菌種染色，老齡的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌會(huì)被染成紅色而造成假陰性。
2）涂片不宜過(guò)厚，以免脫色不完全造成假陽(yáng)性。
3）脫色是革蘭氏染色是否成功的關(guān)鍵，脫色不夠造成假陽(yáng)性，脫色過(guò)度造成假陰性。
4）如用火焰固定涂片時(shí)，將涂面向上，通過(guò)火焰數(shù)次，以手接觸玻片，稍感燙手時(shí)即可。要防過(guò)熱，否則使細(xì)菌變形或影響染色反應(yīng)。

三、抗酸性染色法

抗酸性染色法（acid-fast staining method）是一種鑒別染色法，在普通微生物實(shí)驗(yàn)室不太常用。該染色法1882年由埃利希（F．Ehrlich）首創(chuàng)并經(jīng)F．齊爾（Ziehl）改進(jìn)而創(chuàng)造出的細(xì)菌染色法。

1、實(shí)驗(yàn)原理：結(jié)核分枝桿菌對(duì)苯胺染料一般不易著色，若加溫或延長(zhǎng)染色時(shí)間使其著色后，再用3%鹽酸酒精處理也不易脫色，經(jīng)此染色后，結(jié)核分枝桿菌及其他分枝桿菌呈紅色，而非抗酸菌和細(xì)胞雜質(zhì)等呈藍(lán)色。

2、染液的配制：
1）石炭酸復(fù)紅液：堿性復(fù)紅4g，溶于95%酒精100mL作成飽和溶液，再取該飽和液10mL與5%石炭酸溶液90ml混勻即成。
2）3%鹽酸酒精液：濃鹽酸3mL加入95%酒精97mL中即成。
3）呂(Loeffer)氏美藍(lán)染色液：美藍(lán)2g，溶于95%酒精100mL中，作成飽和液。再取該飽和液30mL與0.01%氫氧化鉀水溶液100mL混合均勻即可。

3、應(yīng)用：主要用于結(jié)核分枝桿菌和奴卡菌的染色鑒定。

4、實(shí)驗(yàn)步驟：
1）涂片：取菌懸液，在清潔無(wú)油脂載玻片上涂開(kāi)，涂抹區(qū)約拇指蓋大。
2）固定：涂片自然干燥后，用片夾挾住玻片一端，通過(guò)火焰固定。
3）染色：涂抹面用濾紙片蓋上，然后往濾紙片上滴加石炭酸復(fù)紅染液，使濾紙片完全被染液浸濕，持載玻片在小火上加溫片刻然后離開(kāi)火焰，此時(shí)可見(jiàn)到玻片上冒出蒸氣。待蒸氣消失后再加溫，如此反復(fù)3~4次，約5min，加溫時(shí)隨時(shí)添加染液勿使紙片干涸。
4）沖洗：玻片冷卻后，用接種環(huán)挑去濾紙扔到污物盆內(nèi)，流水沖洗玻片。
5）脫色：滴加3%鹽酸酒精脫色，至涂抹均勻部位基本沒(méi)有紅色再脫下為止，水洗。
6）染色：滴加呂氏美藍(lán)染液30s，水洗，干燥。
7）鏡檢。

5、注意事項(xiàng)
1）生物樣品在使用時(shí)禁止直接接觸，避免感染。
2）使用完需要滅菌處理并且放置到指定位置統(tǒng)一處理。

四、芽孢染色法

1、實(shí)驗(yàn)原理：芽孢染色法是利用細(xì)菌的芽孢和菌體對(duì)染料的親合力不同的原理，用不同染料進(jìn)行著色，使芽孢和菌體呈不同的顏色而便于區(qū)別。

1）芽孢壁厚、透性低，著色、脫色均較困難，因此，當(dāng)先用一弱堿性染料，如孔雀綠或堿性品紅在加熱條件下進(jìn)行染色時(shí)，此染料不僅可以進(jìn)入菌體，而且也可以進(jìn)入芽孢，進(jìn)入菌體的染料可經(jīng)水洗脫色，而進(jìn)入芽孢的染料則難以透出，若再用復(fù)染液（如番紅液）或襯托溶液（如黑色素溶液）處理，則菌體和芽孢易于區(qū)分。
2）芽胞具有高度的折光性，外膜致密，滲透性低，故普通染色法不易使其著色，芽胞染色法是根據(jù)芽胞既難以著色，而一旦著色又難以脫色的特點(diǎn)設(shè)計(jì)的。所有芽胞染色法都基于同一個(gè)原則：采用著色力強(qiáng)的染料，并加熱以促進(jìn)標(biāo)本著色，然后使菌體脫色，而芽胞上的染料仍保留，經(jīng)復(fù)染后，菌體和芽胞呈現(xiàn)不同的顏色。

2、染液的配制
1）5%孔雀綠水溶液：孔雀綠5.0g，蒸餾水100mL。
2）0.5%番紅溶液：番紅O(safranine，又稱沙黃O)2.5g, 95%乙醇100mL，溶解后可貯存于密閉的棕色瓶中，用時(shí)取20mL與80mL蒸餾水混勻即可。

3、應(yīng)用：芽孢染色法是生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中常用的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，用于觀察和研究細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能。芽孢的大小、形狀及其在菌體內(nèi)的位置是鑒別細(xì)菌的重要依據(jù)。

4、實(shí)驗(yàn)步驟：
1）制片：常規(guī)方法涂片、干燥、固定。
2）浸染：將固定好的涂片放入含5%孔雀綠水溶液的50℃水浴染色缸中，浸染15min。
3）沖洗：取出載玻片，用水沖洗多余染液，直至出水無(wú)色為止。
4）復(fù)染：0.5%堿性番紅復(fù)染1min。
5）沖洗：用水沖洗多余染液，直至出水無(wú)色為止，干燥。
6）鏡檢。

5、注意事項(xiàng)
1）選用適當(dāng)菌齡的菌種，幼齡菌尚未形成芽孢，而老齡菌芽孢囊已經(jīng)破裂。
2）加熱染色時(shí)必須維持在染液冒蒸汽的狀態(tài)，加熱沸騰會(huì)導(dǎo)致菌體或芽孢囊破裂，加熱不夠則芽孢難以著色。

五、莢膜染色法

莢膜染色法是一種典型的負(fù)染色法。

1、實(shí)驗(yàn)原理
1）莢膜是由細(xì)胞壁分泌并聚積在細(xì)菌細(xì)胞壁表面的一層松散的黏液物質(zhì)，沒(méi)有明顯的邊緣，其成分因不同菌種而異，主要是葡萄糖與葡糖醛酸組成的聚合物，有的也含有多肽與脂質(zhì)。
2）莢膜作為細(xì)胞外碳源和能源性儲(chǔ)藏物質(zhì)，能保護(hù)細(xì)胞免受干燥的影響，同時(shí)能增加某些病原菌的致病能力，抵御宿主吞噬細(xì)胞的吞噬。由于莢膜的化學(xué)成分對(duì)染液結(jié)合力很弱，不易著色。但莢膜的滲透性比較好，通常可采用襯托法將染料透過(guò)菌膜，使菌體和背景著色，而莢膜不著色，這樣莢膜從菌體周圍襯托出來(lái)，呈現(xiàn)透明圈。
3）莢膜含水量在90%以上，因此，制片時(shí)一般自然干燥或置于30-40度的培養(yǎng)箱烘干固定，以免莢膜皺縮變形。 

2、染液的配制

齊氏苯酚復(fù)紅染色液：
A液：稱取0.3g堿性復(fù)紅，95%乙醇，在研缽中研磨后，分批加入95%乙醇中，繼續(xù)研磨使其溶解，配制成A液。
B液：稱取5克苯酚，溶解在95mL蒸餾水中，配制成B液?；旌螦液和B液即可。根據(jù)染色需要稀釋5-10倍使用，但稀釋液不易多配，以免變質(zhì)失效。

3、應(yīng)用：用于菌體莢膜的染色。

4、實(shí)驗(yàn)步驟
1）涂片：取一干凈載玻片，滴加一滴蒸餾水于載玻片中央，將接種環(huán)在酒精燈火焰上充分灼燒，冷卻后挑取少量褐色區(qū)域濕潤(rùn)而黏稠的菌落于蒸餾水滴中，充分把菌分散開(kāi)（一般2-3min才能分散均勻）。
2）干燥：將涂片自然干燥或30-40度的培養(yǎng)箱烘干固定。
3）染色：干燥后在涂面上滴加適量齊氏苯酚復(fù)紅染液，染色3-5min。
4）水洗：斜置載玻片，在自來(lái)水龍頭（或洗瓶）下用小股水流沖洗，直至洗下的水呈無(wú)色為止。
5）背景涂黑色素：從載玻片一端滴加1-2滴苯胺黑或碳素墨水，輕輕晃動(dòng)載玻片，使苯胺黑均勻分布于載玻片上。將載玻片上的苯胺黑對(duì)準(zhǔn)日光燈，用吸水紙把多余的錛胺黑吸掉，讓光線能夠透過(guò)即可。
6）干燥：將載玻片自然干燥或30-40度的培養(yǎng)箱烘干。
7）鏡檢：用高倍鏡和油鏡觀察細(xì)菌莢膜形態(tài)。

5、注意事項(xiàng)
1）固定和染色過(guò)程中不能加熱，自然晾干或30-40度的干燥箱內(nèi)烘干。
2）苯胺黑背景盡可能均勻，以免影響觀察。

六、亞甲基藍(lán)染色

亞甲基藍(lán)染色是一種常見(jiàn)的細(xì)胞和組織染色方法，通過(guò)染色劑亞甲基藍(lán)將細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)染色，幫助研究人員觀察細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能。

1、實(shí)驗(yàn)原理
1）利用染色劑亞甲基藍(lán)與DNA或RNA結(jié)合后呈現(xiàn)不同的顏色，從而觀察細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)的結(jié)構(gòu)和形態(tài)。
2）亞甲基藍(lán)是一種帶正電荷的堿性染料，可以與DNA和RNA的負(fù)電荷結(jié)合形成亞甲藍(lán)-DNA或亞甲基藍(lán)-RNA復(fù)合物。當(dāng)亞甲基藍(lán)與DNA或RNA結(jié)合時(shí)，會(huì)吸收特定波長(zhǎng)的光線并反射出不同的顏色。DNA和RNA與亞甲基藍(lán)結(jié)合的程度不同，因此呈現(xiàn)出顏色的深淺也不同，這使得亞甲基藍(lán)染色成為了觀察細(xì)胞核結(jié)構(gòu)及其他親核物質(zhì)定量分析的一種有效方法。

2、染液的配制：54mL95%乙醇與40mL四氯乙烷混合搖勻后，于65攝氏度水浴3min，取出后加0.6g亞甲基藍(lán)，混勻后冷卻至4℃，加6mL冰乙酸，混勻后砂芯漏斗過(guò)濾，常溫保存。

3、應(yīng)用
1）細(xì)胞染色：亞甲基藍(lán)染色法可以用于觀察細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞核的大小和形狀等細(xì)胞特征。
2）染色體分析：通過(guò)亞甲基藍(lán)染色法可以觀察和分析染色體的數(shù)量、結(jié)構(gòu)和缺陷等。
3）核酸染色：亞甲基藍(lán)染色法可以用于檢測(cè)DNA和RNA的存在和定量。
4）細(xì)胞增殖分析：亞甲基藍(lán)染色法可以用于觀察細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期。
5）細(xì)胞毒性分析：通過(guò)亞甲基藍(lán)染色法可以評(píng)估藥物或化合物對(duì)細(xì)胞的毒性。

4、實(shí)驗(yàn)步驟
1）固定：將待染細(xì)胞或組織用4%的多聚甲醛或其他適當(dāng)?shù)墓潭ㄒ汗潭?，一般固定時(shí)間為1-3分鐘。
2）染色：將固定的細(xì)胞或組織連續(xù)浸入亞甲基藍(lán)染色液中，染色時(shí)間一般為2-3分鐘。染色液的配制可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要進(jìn)行調(diào)整。
3）沖洗：用去離子水或緩沖液輕輕洗滌染色的細(xì)胞或組織。洗滌時(shí)間根據(jù)需要可重復(fù)進(jìn)行。
4）干燥：將載玻片自然干燥。
5）鏡檢：用高倍鏡和油鏡觀察細(xì)菌形態(tài)。

5、注意事項(xiàng)
1）固定液的選擇和濃度要適當(dāng)，過(guò)濃或過(guò)稀都會(huì)影響染色效果。
2）染色液的濃度和染色時(shí)間要控制好，過(guò)濃或過(guò)淺都會(huì)導(dǎo)致染色不均勻。
3）洗滌過(guò)程要輕柔，避免造成細(xì)胞或組織的破壞。
4）染色后要及時(shí)觀察和記錄結(jié)果，避免染色體顏色褪色或變化。

6、為什么說(shuō)亞甲基藍(lán)染色是活菌染色？
亞甲藍(lán)染色法是一種常用的細(xì)菌染色方法，它可以使細(xì)菌的染色體染上藍(lán)色，同時(shí)可以區(qū)分細(xì)菌活菌與死菌。
在染色結(jié)果中，活菌的染色體呈現(xiàn)出深藍(lán)色，而死菌則呈現(xiàn)出淺藍(lán)色或無(wú)色。這是因?yàn)閬喖姿{(lán)對(duì)細(xì)胞膜和染色體的親和力較弱，只有在活菌中才能充分滲透并染色。而死菌細(xì)胞膜已經(jīng)破裂，亞甲藍(lán)無(wú)法滲透到細(xì)胞內(nèi)部染色體上。

文章來(lái)源：環(huán)凱轉(zhuǎn)載于“ 微生物知識(shí)庫(kù)”公眾號(hào)；原標(biāo)題：“細(xì)菌染色方法，超詳細(xì)實(shí)驗(yàn)指南”；作者~發(fā)酵菌人。
轉(zhuǎn)載聲明：本文為轉(zhuǎn)載發(fā)布，僅為分享學(xué)習(xí)目的。對(duì)轉(zhuǎn)載有異議和刪稿要求的原著方，可聯(lián)絡(luò)站點(diǎn)客服刪除。