微生物菌種傳代與保藏
發(fā)布時(shí)間：2019-07-24 瀏覽次數(shù)：6520
一、菌種保藏的意義
菌種是從事微生物學(xué)及生命科學(xué)研究的基本材料，在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中，診斷制品的制備，菌苗的 生產(chǎn)、微生物致病性研究，藥物的抑菌試驗(yàn)及藥品微生物檢驗(yàn)等都有一套完整的菌種.微生 物具有生命活力，在傳代過程中易發(fā)生變異甚至死亡，因此菌種保藏是一項(xiàng)重要的基礎(chǔ)工作， 是微生物學(xué)基礎(chǔ)工作的一項(xiàng)重要內(nèi)容，也是藥品微生物工作中的一項(xiàng)常用技術(shù)。 如藥品中的控制菌檢查使用的陽性對照菌須防止因多次傳代而使陽性對照菌的典型生物學(xué) 特征發(fā)生變化及菌株的死亡，保證達(dá)到菌種長期正確的形態(tài)； 如藥品微生物學(xué)檢驗(yàn)過程中，檢出的可疑致病菌須妥善保藏，以達(dá)到進(jìn)一步鑒定的目的，保 證用藥安全。
二、菌種代號的意義
國內(nèi)藥品微生物檢驗(yàn)所用的菌種代號是
CMCC（F）或 CMCC（B）
CMCC —— 中國醫(yī)學(xué)菌種保藏中心
B —— 代表細(xì)菌，
F ——代表真菌。
大腸桿菌 [CMCC (B) 44102]
乙型副傷寒沙門桿菌 [CMCC (B) 50094]
銅綠假單胞菌 [CMCC (B)10104]
金黃色葡萄球菌 [CMCC (B)26003]
生孢梭菌[CMCC(B)64941]
白色念珠菌[CMCC(F)98001]
三、常用菌種保藏方法
(一) 菌種保藏的原理 根據(jù)微生物的菌種生理、生化特性，在人工創(chuàng)造的條件下盡量降低微生物細(xì)胞的代謝強(qiáng)度， 使細(xì)胞基本處于休眠狀態(tài)，生長繁殖受到抑制但又不至于死亡，以減低菌種的變異率。低溫、 干燥、缺氧、缺乏營養(yǎng)等環(huán)境條件都有抑制微生物的代謝作用。因此，低溫、干燥、真空是 用于菌種保藏的重要手段。 選擇保藏方法時(shí)，首先應(yīng)考慮方法能否長期地保持菌種原有的特性，同時(shí)也應(yīng)兼顧到方法的 經(jīng)濟(jì)和簡便。在實(shí)際工作中，往往多種條件同時(shí)使用,以提高保藏效果。
（二）菌種保藏步驟
① 挑選特征典型的純菌菌落；
② 確定保藏的合適菌體形態(tài)；
③ 選擇最適宜的保藏方法；
④ 定期對保藏菌種進(jìn)行檢查，觀察是否發(fā)生變化，若有變化，須改變保藏方法。保藏期滿 應(yīng)及時(shí)進(jìn)行移種。
1. 瓊脂斜面低溫保存法
（1）方法：將經(jīng)常使用的菌種的典型菌落接種在斜面（某些特殊菌種可用液體培 養(yǎng)基）上，按規(guī)定的溫度和時(shí)間培養(yǎng)，待充分生長后，把培養(yǎng)好的新鮮菌種用牛皮 紙保好，為減緩培養(yǎng)基的水分蒸發(fā)，延長保藏時(shí)間，可將菌種保藏管的棉花塞換成 橡膠塞。放在 4℃左右的冰箱中保藏。每隔 2~3 個(gè)月移種一次，繼續(xù)進(jìn)行保藏。若 用半固體高層培養(yǎng)基穿刺培養(yǎng)，一般可保藏半年 ~ 一年。有的甚至更長時(shí)間。
（2）適用范圍：細(xì)菌、酵母菌、霉菌保藏。
（3）特點(diǎn)： 優(yōu)點(diǎn)是——簡便，易于推廣；一般不需要另選擇保藏用培養(yǎng)基；對大多數(shù)微生物都適用。 缺點(diǎn)是——保藏期太短；傳代次數(shù)多，易發(fā)生變異及污染。
（4）注意事項(xiàng)：
? 保藏的菌種應(yīng)是生命活力旺盛的新鮮培養(yǎng)物，至少應(yīng)是第三代的培養(yǎng)物。
? 保藏時(shí)，破傷風(fēng)桿菌可用庖肉培養(yǎng)基；生孢梭菌用流體硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基。
? 必須定期檢查保藏菌種冰箱的溫度、濕度以及菌種管的棉塞是否松動(dòng)或生霉，如有異常 應(yīng)及時(shí)處理。 ? 每次移植后，應(yīng)與原菌種的編號、名稱逐一核對，確證培養(yǎng)基特征和純度無誤后再繼續(xù) 保藏。 ? 保藏菌種的培養(yǎng)基應(yīng)無糖，其他菌類含糖小于 2 %為宜，以免產(chǎn)酸過多，影響菌種存活。
? 銅綠假單胞菌在冰箱中易發(fā)生菌體自溶而死亡，不宜用本法保存。
2. 液體石蠟保存法：
本法是用石蠟將培養(yǎng)物與空氣隔絕，以降低菌種的生理生化水平，并可防止水分蒸發(fā)，從而延長菌種的保藏期。
（1）方法： ? 將菌種接種于斜面或穿刺于 0.3~ 0.5 %瓊脂半固體高層培養(yǎng)基中，培養(yǎng)好備用。 取化學(xué)純的液體石蠟裝在試管中，每管 10~15ml，加棉塞，瓶口包上紙，121℃高壓 滅菌 30min，取出置 37℃溫箱或 110~ 170 ℃烤箱中 1 ~ 2 h 或干燥器內(nèi)除去液體石蠟中的 水分。 ? 將上述液體石蠟加入培養(yǎng)好的菌種試管內(nèi)，液體石蠟液面以高出培養(yǎng)基最上端 1 ㎝為 宜，將試管直立，放入 4℃冰箱中保藏。 ? 適用范圍：適用于保藏部分霉菌，酵母菌和放線菌，對細(xì)菌保藏效果較差。
（2）液體石蠟對各類菌種保藏效果
（3）特點(diǎn) 本方法簡便易行，是實(shí)驗(yàn)室常用的一種保藏方法，該法主要使菌種與空氣隔絕。
（4）注意事項(xiàng)：
① 保藏時(shí)，用新鮮培養(yǎng)物接種，應(yīng)檢查純度和特征后，方可進(jìn)行保藏。
② 保藏過程中，需經(jīng)常觀察斜面是否干燥，如干燥， 需重新移種。
③ 使用菌種時(shí)，先將菌種管傾斜使液體石蠟流至一邊，再用接種針挑取培養(yǎng)物接種到新 鮮斜面上培 養(yǎng)，待長出新培養(yǎng)物后，再移種一次到新斜面上 即可使用。
④ 將沾有少量液體石蠟的接種針浸于 95%酒精中片刻，再燒灼滅菌，以免直接在酒精燈下 燒灼時(shí)，液體石蠟四濺，引起污染。
⑤ 液體石蠟在菌種管中高出培養(yǎng)基的高度要嚴(yán)格控制，如太多，會影響菌種交換氣體，使 保藏效果不好；如太少，斜面容易干燥，將縮短保藏期。一般以高出斜面 1 ㎝為宜。
⑥ 制備無菌液體石蠟時(shí)，每管裝量不能太多，否則分裝到菌種培養(yǎng)基中易造成污染。
