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食品混樣檢測沙門氏菌,采用不同方法驗(yàn)證其準(zhǔn)確性和一致性

發(fā)布時間:2024-12-25    瀏覽次數(shù):392

來源:環(huán)凱轉(zhuǎn)載于“ 六扇門Study”公眾號,作者~SIXDoors

近期在研究混樣檢測可行性時,小六查詢到一篇關(guān)于食品中沙門氏菌混樣檢測方法的驗(yàn)證的文章《Validation of test portion pooling for Salmonella spp. detection infoods》,摘錄部分重點(diǎn)內(nèi)容跟大家分享。


這個實(shí)驗(yàn)是為證明不同食品基質(zhì)中沙門氏菌檢測,混樣(最大375g)增菌檢測與參考的25 g單獨(dú)增菌檢測方法是否存在等效性。比較不同食品基質(zhì),不同檢驗(yàn)方法(培養(yǎng) 、ELISA和RealTime PCR)在檢出概率為50%時的檢測限(LOD50)。


驗(yàn)證規(guī)則:

選擇了6大類食品樣本,23種不同的食品基質(zhì)(根據(jù)ISO 16140-2:2016附件A中選擇),基本可涵蓋全球范圍內(nèi)的食品類別。

每種食品基質(zhì)共測試40個重復(fù)。制備了20個單個測試部分(25g參考樣本量)和20個混合試測試部分(375g替代樣本量),三個接種水平(低、中、高),每個接種水平做2個重復(fù)。

驗(yàn)證方案

菌株添加、操作流程等

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1、菌株添加

不同食品基質(zhì)中添加的沙門氏菌血清型如下表。

不同食品基質(zhì)中添加的沙門氏菌血清型

不同菌株分別從冷凍培養(yǎng)液中轉(zhuǎn)移并培養(yǎng)。

用于接種不同基質(zhì)的菌株需要提前模擬亞致死狀態(tài)操作,即:50°C的水浴中孵育10分鐘。通過比較選擇性瓊脂(XLD培養(yǎng)基)上的菌落數(shù)量(CFU)與非選擇性瓊脂(TSA培養(yǎng)基)上的菌落數(shù)量(CFU),估算菌株熱損傷程度。

熱損傷程度在43%~68%之間,與ISO 16140-2:2016要求一致。


2、實(shí)驗(yàn)操作

將375g混合樣本和25個單獨(dú)樣本,分別加到3375mL和225mLBPW(已經(jīng)提前預(yù)熱到37°C)中,均質(zhì)2min。在37°C±1°C中培養(yǎng),16h至24h(時間長短取決于不同方法)。

注意:對于含有益生菌的食品,需將10 mg萬古霉素溶解于10 ml無菌水中 使用0.22μm的過濾膜進(jìn)行過濾后,將10ml的萬古霉素原液加入到1000 ml的BPW中。


方法1:培養(yǎng)法,參照 ISO 6579:2002,

前增菌培養(yǎng)16 h-20 h后,使用RVS進(jìn)行選擇性增菌,20h-24h后進(jìn)行平板分離,測定菌落濃度。

整體時間預(yù)計:(16 h-20 h)+(20h-24h)+(18 h-24 h)


方法2:GDS法,專有方法

前增菌培養(yǎng)16 h-20 h后,進(jìn)行磁珠富集和熒光PCR檢測。

整體時間預(yù)計:(16 h-20 h)+(2h-2h)+(1.0h-1.5h)


方法3:TPSG法,專有方法

前增菌培養(yǎng)16 h-20 h后,使用RVS進(jìn)行選擇性增菌,之后用ELISA試劑盒檢測。

整體時間預(yù)計:(16 h-20 h)+(18h-24h)+(1.0h-1.5h)


方法4:VIDAS ICS-SLM法,專有方法

前增菌培養(yǎng)18 h-24 h后,使用VIDAS中進(jìn)行自動免疫濃縮,在41.5±1.5°C下繼續(xù)培養(yǎng)5-6h后,采用VIDAS進(jìn)行自動檢測。

整體時間預(yù)計:(18 h-24 h)+(5h-6h)+(1.0h-1.5h)


方法5:VIDAS Easy SLM法,專有方法

前增菌培養(yǎng)16 h和22 h后,使用專用培養(yǎng)基,在41.5±1.5°C下孵育22 h -26 h,之后采用VIDAS進(jìn)行自動檢測。

整體時間預(yù)計:(16 h-22 h)+(22h-26h)+(1.0h-1.5h)


不同檢驗(yàn)方法前增菌培養(yǎng)時間要求如下表:

不同檢驗(yàn)方法前增菌培養(yǎng)時間要求

專有檢驗(yàn)方法,已被驗(yàn)證過的檢出限如下表:

專有檢驗(yàn)方法,已被驗(yàn)證過的檢出限



結(jié)果分析

檢出限、檢出率

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1、不同方法檢出限測試結(jié)果

采用最長增菌時間培養(yǎng)方案進(jìn)行測試,23種食品基質(zhì)種有21種測下下來,RLOD50 < 2.5,是可以接受的。

不同方法檢出限測試結(jié)果

在所有測試方法和條件下,只有一種食品(N° 19巧克力醬)結(jié)果不佳,可能與含有抑菌成分有關(guān),還需要進(jìn)一步研究。


2、最長和最短前增菌時間的研究

為了研究最短和最長前增菌時間對混樣及單個測試結(jié)果的影響,實(shí)驗(yàn)對每種方法和食品基質(zhì)都進(jìn)行了LOD50測試。對25 g樣品進(jìn)行的460個計算,有15個在最短和最長前增菌時間后的LOD50值均為>1 MPN。然而在最短前增菌時間時,混樣增菌的LOD50>1 MPN的兩倍(如下圖),顯然,當(dāng)使用最短的前增菌時間時,混合樣本的LOD50更高。

最長和最短前增菌時間的研究

與 25 g單一測試相比,375 g混樣測試的最短和最長預(yù)增菌培養(yǎng)時間的 LOD50 值不同,這可能是因?yàn)槟承┦称肺⑸锷L受阻有關(guān)。

 

事實(shí)上,假設(shè)微生物在前增菌的培養(yǎng)液中隨機(jī)分布,“為了確保在1ml預(yù)增菌培養(yǎng)物中至少可被轉(zhuǎn)移1個目標(biāo)菌,要求每ml培養(yǎng)物中至少平均存在7個活菌。” (Jarvis, 2007)。


考慮到沙門氏菌在37°C下的最大指數(shù)生長期μ = 0.8-0.9 log cfu/ml/h(Juneja和Marks,2006,Zheng等人,2013),混合樣品(375 g在3.750 L)將比(25 g在225mL)至少需要多培養(yǎng)1.3h-1.5h,才能達(dá)到大致相同的濃度


這種差異可能會對亞致死熱處理損傷的沙門氏菌的假陽性率產(chǎn)生很大影響,其中滯后期可能大于4h (Juneja and Marks, 2006),并且對于存在背景菌群或抑制劑的樣品也是如此。


3、不同方法陽性檢出率結(jié)果

前增菌24h后(最長時間),測定了沙門氏菌的檢出水平(log10cfu/ml)。結(jié)果表明,在5 log10 cfu/ml的水平下,測試方法均可檢出(95%為陽性) ,在濃度為3 log10 cfu/ml的情況下,無論方法如何,82%的樣品檢測出沙門氏菌陽性。

不同方法陽性檢出率結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)論

??對于多種食品基質(zhì),375g混樣增菌后,無論采用何種檢測技術(shù),LOD50結(jié)果是可接受的,并且與25g單檢和375 g混樣,經(jīng)過驗(yàn)證具有很好的一致性。

??在所有測試的方法和條件下,只有一種食品(N° 19巧克力醬)結(jié)果不佳,可能與含有抑制成分有關(guān),還需要進(jìn)一步研究。

??前增菌培養(yǎng)的時間越長,檢測結(jié)果表現(xiàn)出更好(具有高LOD50的基質(zhì)數(shù)量較少)。

??前增菌后沙門氏菌的最終濃度對不同方法的陽性檢出率沒有較大影響。

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