產(chǎn)品名稱：副溶血性弧菌 (TDH/TRH 基因)核酸檢測試劑盒（PCR-熒光探針法）
英文名稱：Rapid Detection Kit for pathogenic Vibrio parahaemolyticus（TDH/TRH gene）(Fluorescent Probe Assays)
產(chǎn)品編號與包裝規(guī)格：
| 編號 | 規(guī)格 |
|---|---|
| FZ008BF2-A | 48 測試/盒 |
產(chǎn)品簡介：本試劑盒適用于水樣糞便、疑似污染的水、食物等樣本中的副溶血性弧菌的快速定性檢測以及耐熱直接溶血素(thermostable direct hemolysin，TDH)、耐熱直接溶血素相關(guān)溶血素 (thermostable direct hemolysin-related hemolysin，TRH)毒力基因的檢測。其他菌種檢驗(yàn)需另按照國標(biāo)《GB4789.7-2013 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 副溶血性弧菌檢驗(yàn)》開展。
檢測原理：基于 Real Time PCR 技術(shù)，利用針對于副溶血性弧菌和毒力基因 TDH 和 TRH 特異性基因的引物、熒光探針以及其他反應(yīng)所需試劑，加入待檢樣品即可進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。在發(fā)生擴(kuò)增過程中，熒光探針與目的基因片段結(jié)合，可被Taq 酶分解并產(chǎn)生熒光信號，此時熒光定量PCR 儀可識別該熒光信號，同時根據(jù)其強(qiáng)弱變化繪制出相應(yīng)的實(shí)時擴(kuò)增曲線，進(jìn)而判定副溶血性弧菌和毒力基因是否檢出。
副溶血性弧菌 (TDH/TRH 基因)核酸檢測試劑盒（PCR-熒光探針法）產(chǎn)品組分：
儲存條件與保質(zhì)期：-20℃避光儲存，有效期為 12 個月，避免反復(fù)凍融。
靈敏度：單通道最低檢驗(yàn)限達(dá)到 100 CFU/Test。
所需其他材料和適用儀器：熒光定量 PCR 儀（具有能夠檢測 FAM、VIC、CY5 標(biāo)記的熒光通道）、高速離心機(jī)、移液器、移液槍頭及離心管等。
副溶血性弧菌 (TDH/TRH 基因)核酸檢測試劑盒（PCR-熒光探針法）使用指南：
1，樣品前處理：
1) 樣品增菌液模板 DNA 的制備：
a) 取 25 g(mL)待檢樣品，置于 225 mL 3%氯化鈉堿性蛋白胨水中，36 ℃±1 ℃前增菌8~18 h。
b) 取以上增菌液 1 mL 到 1.5 mL 規(guī)格的無菌離心管中，6000 r/min 離心 5 min，完全去除上清；
c) 加入 30 μL 裂解液充分懸浮管底沉淀，輕彈管壁消除氣泡，99℃加熱 10 min。
d) 12000 r/min 離心 15 min，上清即為待測樣品 DNA，靜置冰上，長時間不用應(yīng)再次離心。
2) 可疑菌落模板 DNA 的制備：挑取可疑菌落，充分懸浮于預(yù)先加有 30 μL 裂解液的無菌離心管中，后按照上述步驟 c)、d)操作。
2, 加樣、反應(yīng)
1) 按照需求取 n 個 PCR 反應(yīng)管（n=1 管陰性對照+待檢測樣品數(shù)+1 管陽性對照），從試劑盒中取出預(yù)混液，充分融化，渦旋后短暫離心，以上每管加入20 μL預(yù)混液，待用。
2) 向上述 n 個反應(yīng)管中分別加入陰性對照、待測樣品 DNA、陽性對照各 5 μL，總反應(yīng)體積為 25 μL。蓋緊管蓋，短暫離心，立即進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增反應(yīng)。
3) PCR 反應(yīng)體系為 25 μL，取 FAM、VIC、Cy5 檢測通道，在反應(yīng)階段 2 中 60℃時收集熒光信號，具體程序如下：
注：在反應(yīng)階段 2 中 60℃時收集熒光信號，對于多通道熒光 PCR 儀，取熒光素“FAM、VIC 和 CY5”為信號采集通道，淬滅基團(tuán)選擇“None”，染料校正選擇“None”。另外，這 3 個熒光通道分別對應(yīng)副溶血性弧菌特異性基因、TRH 和 TDH 基因的檢測。
3, 結(jié)果：一般情況下，可通過軟件自動設(shè)定的基線、閾值等直接讀取檢測結(jié)果。如需調(diào)整，可根據(jù)所使用儀器的自身情況（如噪聲等）以及選取的不同熒光通道進(jìn)行調(diào)整。
1) 質(zhì)量控制：陰性對照未出現(xiàn)明顯的 S 型擴(kuò)增曲線或Ct 值＞35，陽性對照出現(xiàn) S 型擴(kuò)增曲線且其 Ct 值＜30。若陰陽性對照不同時滿足上述條件，則本次檢測結(jié)果無效，應(yīng)重新檢測或與產(chǎn)品技術(shù)支持聯(lián)系。
2) 結(jié)果判讀：（根據(jù)反應(yīng)所得 Ct 值判讀，具體見下表：）
