大腸桿菌是一種性質(zhì)極其多樣的物種，成為一種模式生物，用于研究細(xì)菌的結(jié)構(gòu)、代謝和行為，并廣泛用于實(shí)驗(yàn)室中的遺傳改造研究。它進(jìn)化適應(yīng)了人類腸道，既作為共生種，也作為致病種。目前我們對(duì)為何該物種表現(xiàn)出致病性和非致病性行為的理解仍然有限。研究表明，這可能是由于三種情況之一：獲得新基因、抗毒力基因的失活，或基因功能發(fā)生變化的點(diǎn)突變。由于基因組與菌株表型之間的復(fù)雜關(guān)系，很難制定出單一的分類系統(tǒng)。系統(tǒng)發(fā)育上的歸類與表型之間沒有明確的聯(lián)系，分類體系的區(qū)分能力差，且臨床菌株范圍廣泛。

隨著新的體外分析數(shù)據(jù)的快速涌入，研究人員經(jīng)常面臨兩個(gè)問題：當(dāng)前方法需要頻繁重新評(píng)估，并且設(shè)計(jì)新的、可靠的診斷工具極其困難。迄今為止，已經(jīng)提出了許多診斷測(cè)試方法，包括生化測(cè)試、血清分型、噬菌體引發(fā)的溶解實(shí)驗(yàn)，或不同變種的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction, PCR）方法。

目前，已經(jīng)開發(fā)了多種PCR檢測(cè)大腸桿菌的方法。最常見的分子靶標(biāo)包括在大多數(shù)大腸桿菌菌株中存在的編碼酶的基因。兩種通常用于PCR檢測(cè)的基因是β-D-半乳糖苷酶（lacZ）和β-D-葡萄糖醛酸酶（uidA）。利用uidA基因可以用于分類那些缺乏酶活性但仍然具有基因序列的大腸桿菌。然而，研究表明，uidA和lacZ基因并不特異于大腸桿菌。此外，區(qū)分侵襲性大腸桿菌（Escherichia coli, EIEC）和與其密切相關(guān)的志賀氏菌也很困難，因?yàn)檫@兩種細(xì)菌在生化和血清學(xué)上構(gòu)成了獨(dú)特的大腸桿菌病原變種。通常通過引物靶向lacY（乳糖通透酶）基因來區(qū)分這兩個(gè)屬，但研究表明該基因并不唯一特異于大腸桿菌。

近日，波蘭羅茲Proteon Pharmaceuticals公司生物信息學(xué)和遺傳學(xué)部Jaros?aw Dastych團(tuán)隊(duì)在Microbiology Spectrum期刊上發(fā)表了題為：Novel multiplex-PCR test for Escherichia coli detectiony論文。

為了解決該問題，本研究提出使用cydA（細(xì)胞色素bd復(fù)合物的一部分）、lacY（編碼乳糖通透酶的基因）和ydiV（調(diào)節(jié)細(xì)菌運(yùn)動(dòng)的基因）這三個(gè)基因?yàn)槎嘀豍CR的靶點(diǎn)。通過這三個(gè)基因的組合，可以生成指定大小的三個(gè)擴(kuò)增子，表明受試菌株屬于大腸桿菌物種。

在該研究中，研究人員決定靶向三個(gè)基因：cydA（編碼細(xì)胞色素bd-I泛醌氧化酶亞基1的基因）、lacY（編碼乳糖通透酶的基因）、ydiV（基因產(chǎn)物參與群體感應(yīng)和運(yùn)動(dòng)調(diào)節(jié)）。為了準(zhǔn)備引物，從NCBI數(shù)據(jù)庫中獲取了這些基因的序列，這些序列來自1171個(gè)完整的大腸桿菌基因組。使用MAFFT進(jìn)行多重序列比對(duì)，選擇保守片段，并基于這些片段構(gòu)建了用于新型多重PCR測(cè)試的引物。

然后，我們?cè)谝粋€(gè)由47370個(gè)不同腸桿菌科基因組組成的大型數(shù)據(jù)集上使用體外PCR（in silico PCR, isPCR）對(duì)這些引物進(jìn)行了測(cè)試。結(jié)果顯示，在19802個(gè)大腸桿菌數(shù)據(jù)集中，我們檢測(cè)到了18963株大腸桿菌，靈敏度為95.76%。在27568個(gè)非大腸桿菌基因組中，有27427株未被檢測(cè)到，特異性為99.49%。整體準(zhǔn)確度達(dá)到了97.93%。該新方法顯示出很高的分辨能力，能夠有效區(qū)分大腸桿菌和非大腸桿菌。特別值得注意的是，與其他診斷方法相比，該方法在區(qū)分大腸桿菌和志賀氏菌方面表現(xiàn)出色。

在相同的數(shù)據(jù)集上使用其他研究人員提出的條件進(jìn)行了isPCR，并根據(jù)敏感性、特異性和準(zhǔn)確性將這些方法與本研究提出的多重PCR進(jìn)行了比較。

本研究開發(fā)的多重PCR顯示出與之前發(fā)表的檢測(cè)方法相當(dāng)，甚至略高的準(zhǔn)確性（97.93%）。將志賀氏菌與大腸桿菌區(qū)分開仍然是一個(gè)診斷難題。我們的方法對(duì)志賀氏菌屬的特異性為95.93%，高于其他方法。

圖1 散點(diǎn)圖，其中x軸表示靈敏度/召回率（檢測(cè)到的大腸桿菌的比例），而y軸表示特異性（正確檢測(cè)的比例）。點(diǎn)越靠近右上角，準(zhǔn)確度越高。這些參數(shù)是根據(jù)對(duì)腸桿菌科數(shù)據(jù)集執(zhí)行的isPCR計(jì)算得出的。點(diǎn)填充的顏色表示測(cè)試的檢測(cè)方法，與框中的圖例相對(duì)應(yīng)。點(diǎn)越靠近右上角，準(zhǔn)確度越高。

圖2 顯示了不同大腸桿菌檢測(cè)方法的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確度的條形圖。

下一步是對(duì)設(shè)計(jì)的多重PCR進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室條件下的驗(yàn)證。為此，提取了20株大腸桿菌和20株非大腸桿菌菌株的基因組DNA。為了檢查獲得真陽性結(jié)果的可能性，使用了20株大腸桿菌菌株的基因組材料。所有測(cè)試的樣本均成功擴(kuò)增了用于鑒定大腸桿菌所需的三個(gè)基因（如圖3所示），獲得真陽性結(jié)果的概率為100%。

圖3 cydA、lacY、ydiV基因在細(xì)菌菌株基因組DNA上多重?cái)U(kuò)增后的PCR產(chǎn)物（2%瓊脂糖凝膠電泳）。NTC—無模板對(duì)照，PC—陽性對(duì)照。M—marker；圖左側(cè)以bp為單位顯示分子大小標(biāo)記的大小。

為了檢查獲得真陰性結(jié)果的可能性，使用了20株非大腸桿菌的腸桿菌目菌株的基因組DNA。測(cè)試的所有樣本均未顯示出三個(gè)基因的擴(kuò)增，因此未獲得假陽性結(jié)果，真陰性結(jié)果的概率為100%。

為了確定對(duì)特定樣本進(jìn)行技術(shù)復(fù)現(xiàn)的結(jié)果總和與測(cè)試樣本數(shù)量之比，使用了10株被鑒定為大腸桿菌的菌株和10株被鑒定為非大腸桿菌的菌株。每個(gè)菌株進(jìn)行了10次技術(shù)重復(fù)，成功復(fù)現(xiàn)真陽性或真陰性結(jié)果的概率為100%。

圖4 cydA、lacY、ydiV基因在細(xì)菌基因組DNA上多重?cái)U(kuò)增后的PCR產(chǎn)物（2%瓊脂糖凝膠電泳）。NTC—無模板對(duì)照，PC—陽性對(duì)照。M—marker；圖左側(cè)以bp為單位顯示分子大小標(biāo)記的大小。

為了評(píng)估正確診斷結(jié)果所需的最小DNA量，使用了八種不同濃度的大腸桿菌基因組DNA（每次反應(yīng)加入110-0 ng的DNA）。凝膠電泳結(jié)果如圖5所示，除了0 ng（無模板對(duì)照——NTC）之外，每個(gè)濃度下均獲得了三個(gè)基因的擴(kuò)增產(chǎn)物，足以做出正確的診斷。

圖5 cydA、lacY、ydiV基因在大腸桿菌不同量基因組DNA上多重?cái)U(kuò)增后的PCR產(chǎn)物（2%瓊脂糖凝膠電泳）。NTC—無模板對(duì)照，PC—陽性對(duì)照。M—標(biāo)記物；圖左側(cè)以bp為單位顯示分子大小標(biāo)記物的大小。

PCR測(cè)試用于細(xì)菌混合物時(shí)，可能會(huì)從三個(gè)不同的細(xì)菌基因組中檢測(cè)到每個(gè)擴(kuò)增子之一，從而導(dǎo)致假陽性信號(hào)。這種局限性通常出現(xiàn)在其他多基因檢測(cè)方法中，而單基因檢測(cè)方法則沒有這個(gè)問題。盡管單基因檢測(cè)方法可能較為方便，使用靶向多個(gè)基因（cydA、lacY和ydiV）的引物對(duì)可以確保在按程序執(zhí)行的情況下減少假陽性檢測(cè)的可能性，且每個(gè)檢測(cè)到的擴(kuò)增子還提供了代謝相關(guān)的信息。綜上所述，該測(cè)試可用于快速、可靠地識(shí)別大腸桿菌，例如用于疑似敗血癥、新生兒腦脊液感染和腦膜炎等的臨床診斷中。

論文來源：https://doi.org/10.1128/spectrum.03773-23

來源：微生物安全與健康網(wǎng)，作者~段子璇。