在養(yǎng)細(xì)胞的過程中，總會(huì)有一些不速來客，它們總會(huì)不請(qǐng)自來，比如真菌、霉菌。但最令人頭疼的還是支原體，它總是悄悄的來，對(duì)細(xì)胞造成極大的危害，今天就來認(rèn)識(shí)一下支原體。

1 支原體是什么？

支原體是目前為止發(fā)現(xiàn)的最小的原核生物，具有以下特點(diǎn)：
      1. 形態(tài)結(jié)構(gòu)與細(xì)菌相似，但又比細(xì)菌小，是介于細(xì)菌與病毒之間的微生物；
      2. 結(jié)構(gòu)簡單，只有細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)、核糖體、DNA、可溶性RNA和一些其它細(xì)胞內(nèi)含物，支原體的細(xì)胞器只有核糖體；
      3. 沒有細(xì)胞壁，具有多種形態(tài)，絲狀、球狀、扁平狀等；
      4. 體積小，最小的只有0.1μm，部分支原體可通過0.22μm濾器，但過濾器并不能完全去除支原體。

2 支原體如何危害細(xì)胞？

支原體污染一般在顯微鏡下不可見，很難察覺，但細(xì)胞會(huì)受到極大的損傷，主要通過以下途徑影響細(xì)胞生長及功能。

3 支原體來自哪里？

1. 污染細(xì)胞支原體的種類
    污染細(xì)胞的種類有在二十種以上，其中95%以上的支原體污染是口腔支原體、精氨酸支原體、發(fā)酵支原體、萊氏無膽甾原體和豬鼻支原體五種。

2. 支原體污染的來源
    a. 環(huán)境污染：如細(xì)胞培養(yǎng)房、細(xì)胞培養(yǎng)箱、超凈工作臺(tái)內(nèi)已被支原體污染；
    b. 實(shí)驗(yàn)器材的污染：移液槍、移液管、細(xì)胞培養(yǎng)皿、水浴鍋等；
    c. 細(xì)胞培養(yǎng)試劑的污染：培養(yǎng)基、胰酶、血清、細(xì)胞凍存液等；
    d. 污染的原代細(xì)胞；
    e. 操作人員操作帶來的污染等；

3 如何預(yù)防支原體？

支原體危害這么大，我們應(yīng)該如何應(yīng)對(duì)？我們可以從以下幾個(gè)方面預(yù)防支原體：

1. 定期消毒：定期對(duì)細(xì)胞房、實(shí)驗(yàn)服、移液槍、細(xì)胞培養(yǎng)箱等進(jìn)行消毒，及時(shí)清除支原體；

2. 檢查細(xì)胞培養(yǎng)試劑：選擇來源可靠的試劑及耗材產(chǎn)品，在進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)操作之前，檢查細(xì)胞培養(yǎng)基、血清、胰酶等試劑，可選擇合適孔徑的濾膜進(jìn)行過濾除菌，使用過程中如發(fā)現(xiàn)有污染應(yīng)及時(shí)更換；

3. 規(guī)范細(xì)胞培養(yǎng)操作：建立良好的細(xì)胞培養(yǎng)操作SOP，遵循無菌操作原則，規(guī)范穿戴實(shí)驗(yàn)服、口罩、手套等，并在細(xì)胞培養(yǎng)開始時(shí)進(jìn)行消毒；規(guī)范處理實(shí)驗(yàn)廢棄物；

4. 在培養(yǎng)基中加入支原體預(yù)防試劑：
    加入抑制支原體DNA合成的抗生素：例如氟喹諾酮類抗生素；
    加入抑制支原體蛋白質(zhì)合成的抗生素：例如大環(huán)內(nèi)酯類、四環(huán)素、雙萜烯類等抗生素；
    加入非抗生素類支原體清除試劑：如膜活性多肽，通過與支原體膜特異性結(jié)合徹底清除支原體。

4 支原體檢測方法有哪些？

1.分離培養(yǎng)法：

檢測方法：將待檢樣品接種到適合支原體生長的液體培養(yǎng)基或固體培養(yǎng)基中，如有支原體污染，液體培養(yǎng)基顏色會(huì)改變，固體培養(yǎng)基將會(huì)有菌落瘋狂生長。
優(yōu)點(diǎn)：該方法被稱為支原體培養(yǎng)法的金標(biāo)準(zhǔn)，可以檢測絕大多數(shù)支原體。
缺點(diǎn)：支原體生長到一定數(shù)量才能判斷是否有污染，檢測時(shí)間長，無法實(shí)現(xiàn)對(duì)支原體的快速檢測

2.原位染色法：

檢測方法：通過染色試劑（如DAPI、Hoechst 等）對(duì)待測細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行染色，在熒光顯微鏡下觀察待測樣品的熒光判斷支原體污染。
優(yōu)點(diǎn)：可清晰直觀的看到支原體微粒。
缺點(diǎn)：死亡細(xì)胞釋放的DNA也會(huì)被染色，在支原體輕度污染時(shí)，較難判斷是否有支原體污染。

3.化學(xué)發(fā)光法

檢測方法：利用支原體特有酶的活性并通過ATP依賴的螢光素酶催化的發(fā)光反應(yīng)進(jìn)行檢測，通過比較檢測試劑加入前后ATP量的變化來確定樣品是否有支原體污染。
優(yōu)點(diǎn)：檢測快速，僅需15min即可完成檢測。
缺點(diǎn)：該方法只能檢測活的支原體，如果支原體死亡，將無法通過ATP的變化判斷支原體污染。

4.巢式PCR法：

檢測方法：通過設(shè)計(jì)兩對(duì)引物擴(kuò)增支原體的DNA，第一對(duì)引物用于第一步PCR，用于初步判斷是否有支原體污染；用第二對(duì)引物進(jìn)行第二輪PCR，觀察DNA條帶用于鑒定是否有支原體污染。
優(yōu)點(diǎn): 通過兩輪PCR可以大大提高檢測的特異性和靈敏度，可根據(jù)擴(kuò)增片段的大小大致預(yù)測支原體的種屬。
缺點(diǎn)：操作繁瑣，需要進(jìn)行兩輪PCR。

5.探針法qPCR：

檢測方法：設(shè)計(jì)特異性引物和熒光探針，通過探針法qPCR高靈敏檢測培養(yǎng)的細(xì)胞等生物材料中是否有支原體污染。
優(yōu)點(diǎn)：靈敏度高，檢測快速，可一次性檢測大量樣品，PCR擴(kuò)增后無需電泳分析即可判斷是否具有支原體污染。
缺點(diǎn)：該方法靈敏度很高，因此對(duì)實(shí)驗(yàn)環(huán)境要求較為苛刻，且需要精密的qPCR儀器。

6.等溫?cái)U(kuò)增變色法：

檢測方法：通過設(shè)計(jì)4-6對(duì)特異性引物，在一定的恒定溫度下，通過添加不同活性的酶和各自特異性引物進(jìn)行核酸的快速擴(kuò)增，并且通過顏色變化而無需電泳分析即可確定是否有支原體污染。
優(yōu)點(diǎn)：不需要反復(fù)的升溫和降溫，不需要精密的儀器，在恒定的溫度下即可對(duì)核酸進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)結(jié)束后，無需電泳分析，通過顏色變化即可判斷是否具有支原體污染。
缺點(diǎn)：對(duì)引物要求較高，需要設(shè)計(jì)多對(duì)引物，且擴(kuò)增產(chǎn)物不能用于測序。

5 細(xì)胞被污染，怎么辦？

如果細(xì)胞被支原體污染，不要著急，也不要棄掉，我們可以及時(shí)清除支原體，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行挽救，減少支原體對(duì)細(xì)胞的危害。

1.及時(shí)更換培養(yǎng)液：可以減緩支原體的污染，但不能完全清除；

2.使用抗生素類去除試劑：抗生素對(duì)支原體有較好的抑制作用，可以有效清除支原體，但長時(shí)間使用抗生素，會(huì)產(chǎn)生耐藥性的風(fēng)險(xiǎn)。在使用單一抗生素清除效果不佳時(shí)，可以考慮更換抗生素或者采用復(fù)合型抗生素試劑；

3.使用非抗生素去除試劑：非抗生素清除試劑不會(huì)產(chǎn)生耐藥性，對(duì)支原體的清除效果可以達(dá)到100%，且?guī)缀鯇?duì)細(xì)胞沒有影響，是去除支原體的首選試劑。

4.實(shí)驗(yàn)室環(huán)境清潔：發(fā)生支原體污染后，應(yīng)及時(shí)處理已被污染的細(xì)胞，并對(duì)細(xì)胞房進(jìn)行徹底的清潔和消殺，防止交叉污染。

細(xì)胞培養(yǎng)過程中細(xì)菌和真菌污染其實(shí)也是很令人頭疼的事情。除了在培養(yǎng)液中添加一定比例的抗生素外，也建議大家定期對(duì)細(xì)胞房、培養(yǎng)箱進(jìn)行清潔除菌。

實(shí)驗(yàn)過程中，我們的細(xì)胞很珍貴，實(shí)驗(yàn)試劑也屬實(shí)不便宜呢，雖說我們現(xiàn)在已經(jīng)擁有了各種各樣的支原體清除和除菌劑產(chǎn)品，但是避免污染的最好方式還是注意實(shí)驗(yàn)規(guī)范以及定期清潔，為了不給細(xì)菌、真菌、支原體卷土重來的機(jī)會(huì)，最好同時(shí)把實(shí)驗(yàn)環(huán)境中的污染源也一起消滅，最后希望大家的實(shí)驗(yàn)都順順利利，遠(yuǎn)離污染。

來源：環(huán)凱轉(zhuǎn)載于“Super Lab”公眾號(hào)；
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