產(chǎn)品名稱：pSec Expression Kit
產(chǎn)品編號(hào)與包裝規(guī)格：
| 編號(hào) | 產(chǎn)品名稱 | 規(guī)格 | 產(chǎn)品介紹 | 價(jià)格 |
| HKV106-01A | pSec Expression Kit | 1μg/20次 | 表達(dá)載體 | 750 |
產(chǎn)品描述：
pSec 專為目標(biāo)蛋白在大腸桿菌中高效分泌表達(dá)設(shè)計(jì)，是預(yù)先用 Xho I 線性化的載體，可配合 Plus PCR 產(chǎn)物一步無縫克隆試劑盒 （Cat.No：HKNR005）使用。外源蛋白在大腸桿菌中表達(dá)容易形成包涵體，使獲得有生物學(xué)活性的蛋白增加困難。同時(shí)大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)為還原環(huán)境，目標(biāo)蛋白二硫鍵無法形成。周質(zhì)分泌是獲得正確折疊的目標(biāo)蛋白質(zhì)的有效途徑，常見表達(dá)載體往往由于蛋白表達(dá)過快，目標(biāo)蛋白來不及正確折疊和分泌而形成包涵體。該質(zhì)粒適用于阿拉伯糖誘導(dǎo)，有較強(qiáng)的劑量依賴性。合適的阿拉伯糖濃度能夠在保障表達(dá)效率的同時(shí)獲得有效的蛋白質(zhì)分泌。
目的基因擴(kuò)增按常規(guī)方法設(shè)計(jì)引物后，在上游引物 5′端引物前添加以下序列：CCG GCG ATG GCC ATG；下游引物 5′端引物前添加：CGC GGC CGC AAG CTT。
注意：5′端引物從第一個(gè)氨基酸不是甲硫氨酸（ATG）時(shí)，可使用 CAG CCG GCG ATG GCC。不希望目標(biāo)蛋白 C 端保留 His Tag 時(shí)，3′端引物需要加入終止密碼子。
產(chǎn)品特點(diǎn)：
pSec 專為目標(biāo)蛋白在大腸桿菌中高效分泌表達(dá)設(shè)計(jì)。
Plus PCR 一步定向克隆試劑盒操作簡便，一步完成質(zhì)粒構(gòu)建。
保存溫度：-20℃
pSec Expression Kit 產(chǎn)品包裝（A包裝）：
| 產(chǎn)品組成 | 體積 |
| pSec（25ng/μl） | 40μl |
| Plus Recombinase | 20μl |
| 5×Reaction Buffer | 100μl |
| Control Insert（50ng/μl） | 10μl |
質(zhì)量保證：pSec 線性化載體經(jīng)過嚴(yán)格的自連測試以及連接效率測試，滿足下游實(shí)驗(yàn)需求。
注意事項(xiàng)：
1）目的片段的 PCR 產(chǎn)物建議純化，避免引物二聚體等雜質(zhì)影響連接反應(yīng)。
2）目的片段與載體的摩爾比在 2:1。
3）引物設(shè)計(jì)要保證目的片段兩端有至少 15bp序列與線性化載體的兩端一致。
使用方法：
A 目的片段的獲得
目的片段通常通過 PCR 獲得。引物設(shè)計(jì)要保證目的片段兩端有至少 15bp 序列與線性化載體的兩端序列一致。為保證 PCR擴(kuò)增的保真度，請(qǐng)盡可能選用高保真酶，推薦使用 Fast Pfu DNA 聚合酶（Cat.No:HKE031）。PCR 每條引物長度至少在 35- 40bp，包括 5'端與載體同源的 15b 序列以及目的片段特異性 20- 25bp 序列。
（注意：如果是表達(dá)載體克隆構(gòu)建，引物設(shè)計(jì)完成后，請(qǐng)注意 檢 查讀碼框是否正確。）
B 目的片段與載體的重組
C 轉(zhuǎn)化（我們建議所使用的感受態(tài)細(xì)胞效率要大于5×106 cfu/μg。轉(zhuǎn)化步驟如下：）
1，冰上融化一支感受態(tài)細(xì)胞，輕彈管壁使細(xì)胞重懸起來。加入 10μl 的反應(yīng)液到感受態(tài)細(xì)胞中，用移液 槍吹打混合，冰上放置 30 分鐘。
2，將離心管置于 42℃水浴中，熱擊 60-90 秒，迅速將離心管置于冰上，放置 2-3 分鐘。
3，向每個(gè)離心管中加入 500μl 無菌不含抗生素的LB 或 SOC 培養(yǎng)基中，37℃搖床，150rpm 振蕩培養(yǎng) 45 分鐘，使質(zhì)粒上氨芐抗性基因表達(dá)，菌體復(fù)蘇。
4，吸取 200μl 已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞，加到含氨芐青霉素的 LB 或 SOC 固體平板上，用無菌涂布棒將細(xì)胞均勻涂開，將平板置于 37℃培養(yǎng)箱里直至液體完全吸收，倒置培養(yǎng) 12-16 小時(shí)。
D 陽性克隆鑒定
PCR 檢測，利用高速 PCR 擴(kuò)增試劑 2×Fast Taq Master Mix（Cat.No:HKE029）直接進(jìn)行菌落 PCR 鑒定。
鑒定引物的選擇：為避免假陽性結(jié)果，我們建議一條引物為載體特異性引物，另一條引物為目的片段特異性引物。
pSec 結(jié)構(gòu)圖：
| pBAD promoter | 3 - 277 |
| pelB leader | 319-435 |
| rrnB Terminator | 456-881 |
| Amp resistance | 974-1834 |
| pBR322 ori | 1979-2652 |
| AraC CDS | 3183-4085 |
